張興吉，葛武鵬,*，劉 陽，王 瑞，王 智，李小鵬

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西百躍優(yōu)利士乳業(yè)有限公司，陜西 西安 710000；3.咸陽市食品藥品檢測(cè)檢驗(yàn)中心，陜西 咸陽 712000）

我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵乳品資源豐富，西部牧區(qū)是我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵乳品的主要產(chǎn)區(qū)，生活在新疆、青海、甘肅、內(nèi)蒙古、西藏等牧區(qū)的牧民利用馬乳、牛乳、駱駝乳、羊乳等為原料，通過傳統(tǒng)的發(fā)酵方式自制成各類發(fā)酵乳品食用[1-3]。西部牧區(qū)因其特殊的地理氣候環(huán)境以及牧民的生活習(xí)慣造就了其獨(dú)特的微生物資源[4-5]，在發(fā)酵乳品制作過程中，伴隨著以乳酸菌為主的微生物生長(zhǎng)代謝活動(dòng)[6]。乳酸菌是傳統(tǒng)發(fā)酵乳品中微生物菌群的優(yōu)勢(shì)菌，且傳統(tǒng)發(fā)酵乳品的保健功能離不開乳酸菌的作用[7]。目前乳酸菌分離鑒定方法分為常規(guī)鑒定、快速鑒定、基因分子鑒定方法等，其中常規(guī)鑒定和快速鑒定方法存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力、準(zhǔn)確率低于基因分子鑒定方法等缺點(diǎn)，而基因分子鑒定方法因其具有鑒定結(jié)果準(zhǔn)確、方法成熟以及省時(shí)省力等優(yōu)點(diǎn)而被視為常用的菌株鑒定方法[8]。

在食品行業(yè)中，硝酸鹽和亞硝酸鹽雖然被允許作為食品添加劑使用，在食品工業(yè)中起到重要的作用。然而硝酸鹽和亞硝酸鹽含量超過安全范圍將會(huì)對(duì)人體造成危害，特別是亞硝酸鹽危害健康更甚，過量會(huì)積累多種疾病，如癌癥、克山病、氰紫癥、智力下降等[9-12]。在牲畜喂養(yǎng)過程中，如果環(huán)境、飼料、飲水中硝酸鹽、亞硝酸鹽含量過高，可能導(dǎo)致其乳中的亞硝酸鹽含量超標(biāo)[13-14]，故亞硝酸鹽含量一直作為乳品質(zhì)量檢測(cè)的重要指標(biāo)，受到廣泛關(guān)注。文獻(xiàn)表明，乳酸菌具有降解亞硝酸鹽特性[15]。乳酸菌具備亞硝酸鹽降解能力主要因其在生長(zhǎng)代謝過程中會(huì)產(chǎn)生乳酸和一系列酶對(duì)亞硝酸鹽具有降解作用[16]，同時(shí)在發(fā)酵體系中乳酸菌成為優(yōu)勢(shì)菌時(shí)，可抑制其他雜菌的生長(zhǎng)，從而抑制亞硝酸鹽的產(chǎn)生。目前，乳酸菌降解亞硝酸鹽的研究多集中于泡菜和酸菜等資源上，而對(duì)于從傳統(tǒng)發(fā)酵乳品中分離出乳酸菌進(jìn)行亞硝酸鹽降解能力分析的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。本研究通過對(duì)西部牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳品中乳酸菌分離鑒定及其優(yōu)勢(shì)菌種亞硝酸鹽降解能力分析比較，分別從地區(qū)、乳品品種及乳酸菌種類等方面探究其能力差異，為乳酸菌新資源發(fā)掘及其合理化利用提供參考依據(jù)[17]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

2016年8月分別在青海牧區(qū)采集15 份酸牦牛奶和2 份奶渣，甘肅牧區(qū)采集5 份酸牦牛奶，內(nèi)蒙古牧區(qū)采集21 份酸馬奶和8 份酸駝奶，新疆牧區(qū)采集20 份酸馬奶和9 份酸駝奶，西藏牧區(qū)采集24 份奶渣樣品，裝入50 mL無菌離心管中，冰盒冷鏈至實(shí)驗(yàn)室，放入4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限公司。

革蘭氏染色試劑盒 北京陸橋技術(shù)有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR） Premix TaqTM日本Takara公司；放線菌酮 美國(guó)Inalco公司；亞硝酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、硼砂 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；引物上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

E100生物顯微鏡 日本尼康公司；T100TMThermal Cycler PCR儀、E1617-T130 plus凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；DYY-6C電泳儀 君意東方公司；DRP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；YXQ-LS-50SII-01-00立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；HC3018型高速離心機(jī) 安徽科大中佳有限公司；UV-2600型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌分離純化

將樣品進(jìn)行梯度稀釋，吸取0.5 mL樣品于含4.5 mL無菌水的離心管中，渦旋混勻，將樣品稀釋至10-5，選取10-3、10-4、10-5三個(gè)梯度的稀釋液在MRS固體培養(yǎng)基（含40 mg/L放線菌酮）上進(jìn)行平板涂布，于37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。觀察并記錄菌落的特征，經(jīng)肉眼及顯微鏡下菌落形態(tài)的觀察分出不同菌落，對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色證實(shí)為革蘭氏陽性的菌落，在MRS瓊脂培養(yǎng)基上連續(xù)劃線2 次，進(jìn)行純化。將培養(yǎng)好的菌種編號(hào)并接種于30%甘油管中，置于-80 ℃冰箱中保存。

1.3.2 乳酸菌鑒定

基因組DNA提?。喊凑占?xì)菌基因組DNA提取試劑盒明示的方法提取乳酸菌DNA。

PCR擴(kuò)增：分別對(duì)待測(cè)菌的16S rDNA序列27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR體系：DNA模板1 μL，正反向引物各1 μL（20 pmol/μL），超純水22 μL，PCR Premix TaqTM25 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，循環(huán)25次；72 ℃延伸10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將出現(xiàn)條帶的PCR產(chǎn)物交由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后，以相似度在99%以上為標(biāo)準(zhǔn)確定分離菌株的屬種。

1.3.3 乳酸菌亞硝酸鹽降解能力分析

1.3.3.1 菌株培養(yǎng)

將待測(cè)菌株接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中于37 ℃活化2 代后，以體積分?jǐn)?shù)1%的量接種到8 mL含有150 mg/L亞硝酸鈉的MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h[18-19]。

1.3.3.2 亞硝酸鹽測(cè)定

采用比色法對(duì)乳酸菌降解亞硝酸鹽能力進(jìn)行測(cè)定。菌株培養(yǎng)24 h后，于8 000×g離心10 min，取0.15 mL上清液依次加入0.75 mL飽和硼砂溶液、0.3 mL 106 g/L亞鐵氰化鉀溶液、0.3 mL 220 g/L乙酸鋅溶液，然后加入28.5 mL超純水，混勻，室溫放置30 min，于6 500×g離心5 min。取20 mL上清液加入比色管中，加入1 mL4 g/L對(duì)氨基苯磺酸溶液，搖勻，靜置5 min，再加入0.5 mL2 g/L鹽酸萘乙二胺溶液，超純水定容至25 mL，搖勻，靜置15 min。零管調(diào)零，1 cm比色杯于538 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，同時(shí)以不接菌的無亞硝酸鈉MRS肉湯、不接菌的含150 mg/L亞硝酸鈉MRS肉湯為空白對(duì)照[18]。通過亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線得到空白對(duì)照和樣品中亞硝酸鈉濃度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：吸取0.00、1.00、2.00、3.00 mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液（5.0 μg/mL），分別置于25 mL比色管中，加入1 mL4 g/L對(duì)氨基苯磺酸溶液，充分混勻，室溫靜置5 min，再加入0.5 mL2 g/L鹽酸萘乙二胺溶液，用超純水定容至25 mL，充分混勻，室溫靜置15 min?？瞻渍{(diào)零，用1 cm比色杯于538 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2應(yīng)大于0.999。

菌株亞硝酸鹽降解能力基于培養(yǎng)基中亞硝酸鹽的降解率計(jì)算[19]。公式如下：

式中：C0為不接菌的含150 mg/L亞硝酸鈉MRS肉湯培養(yǎng)基中亞硝酸鹽濃度/（mmol/L）；C1為測(cè)試樣品中亞硝酸鹽濃度/（mmol/L）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，使用SPSS 19.0和Excel軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，結(jié)果采用 ±s表示，顯著性水平設(shè)定為P小于0.05。通過頻數(shù)統(tǒng)計(jì)對(duì)分離出的乳酸菌亞硝酸鹽降解率的不同區(qū)間進(jìn)行歸納分類。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌分離鑒定

從青海、甘肅、新疆、內(nèi)蒙古、西藏5地104 份傳統(tǒng)發(fā)酵乳品中共分離得到275 株乳酸菌，鑒定出6 個(gè)屬23 個(gè)種：分別為L(zhǎng)actobacillus屬12 種，Leuconostoc屬4 種，Enterococcus屬3 種，Lactococcus屬2 種，Streptococcus屬1 種，Pediococcus屬1 種。其中，地區(qū)間比較，青海、甘肅、內(nèi)蒙古、新疆、西藏樣品中分別分離出44、11、76、73、71 株菌；乳品品種間比較，酸牦牛奶、酸馬奶、酸駝奶、奶渣中分別分離出52、112、37、74 株菌。菌株信息如表1所示。

表1 西部地區(qū)分離乳酸菌菌株信息Table1 Information about LAB isolated from fermented milk products from western China

不同地區(qū)因其海拔、地貌、溫度、氣候、季節(jié)以及牧民生活習(xí)慣等因素導(dǎo)致不同發(fā)酵乳品中存在著復(fù)雜多樣的菌群微生態(tài)結(jié)構(gòu)，具有特定的優(yōu)勢(shì)乳酸菌類群，在分離出的23 種乳酸菌中，突出的表現(xiàn)在于：L. helveticus為青海、甘肅、新疆、內(nèi)蒙古、西藏5 個(gè)地區(qū)發(fā)酵乳品中共有菌株；L. helveticus和L. plantarum為酸牦牛奶、酸馬奶、酸駝奶、奶渣4 種傳統(tǒng)發(fā)酵乳品中共有菌株。不同地區(qū)、不同發(fā)酵乳品中乳酸菌組成存在明顯差異，以菌株篩分率為基準(zhǔn)，青海地區(qū)發(fā)酵乳品中優(yōu)勢(shì)菌為L(zhǎng).helveticus和德式乳桿菌保加利亞亞種（L. delbrueckii ssp.bulgaricus）；新疆和甘肅地區(qū)發(fā)酵乳品中優(yōu)勢(shì)菌均為L(zhǎng). helveticus；內(nèi)蒙古地區(qū)發(fā)酵乳品中優(yōu)勢(shì)菌為馬乳酒樣乳桿菌（L. kefiranofaciens）和L. helveticus；西藏地區(qū)發(fā)酵乳品中優(yōu)勢(shì)菌為L(zhǎng). breris、L. plantarum、干酪乳桿菌（L. casei）和L. paracasei。酸牦牛奶中優(yōu)勢(shì)菌為L(zhǎng).helveticus和L. delbrueckii ssp. bulgaricus；酸馬奶和酸駝奶中優(yōu)勢(shì)菌均為L(zhǎng). kefiranofaciens和L. helveticus；奶渣中優(yōu)勢(shì)菌為L(zhǎng). breris、L. plantarum、L. casei和L. paracasei。本研究的優(yōu)勢(shì)菌篩分結(jié)果與先前研究相一致，L. helveticus在大多數(shù)傳統(tǒng)發(fā)酵乳品中都具有較高的篩分頻率，李遠(yuǎn)等[20]對(duì)新疆不同地區(qū)酸駝奶中乳酸菌進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果表明L. helveticus為新疆酸駝奶中優(yōu)勢(shì)菌株。Sun Zhihong等[21]對(duì)新疆、內(nèi)蒙古、青海地區(qū)酸馬奶中乳酸菌多樣性進(jìn)行了系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)L. helveticus為新疆酸馬奶中優(yōu)勢(shì)菌株，而L. casei、L. helveticus和L. plantarum在內(nèi)蒙古酸馬奶中分離出的頻率較高。Watanabe等[22]對(duì)蒙古國(guó)中央省等6 個(gè)地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳品中乳酸菌多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果表明L. helveticus和L. kefiranofaciens為蒙古國(guó)中央省酸馬奶中的優(yōu)勢(shì)菌株。Airidengcaicike等[23]對(duì)西藏酸牛奶中乳酸菌進(jìn)行篩分，發(fā)現(xiàn)藏北地區(qū)的優(yōu)勢(shì)菌株為發(fā)酵乳桿菌（L. fermentum）和L. casei，藏南地區(qū)的優(yōu)勢(shì)菌株則為L(zhǎng). casei和L. plantarum。

目前，有關(guān)傳統(tǒng)發(fā)酵乳品中乳酸菌多樣性報(bào)道較多，相同地域可能存在不同的優(yōu)勢(shì)乳酸菌類群。Sun Zhihong等[24]從青海地區(qū)43 份自然發(fā)酵牦牛奶中分離出148 株乳酸菌，發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌（S. thermophilus）、L. delbrueckii ssp. bulgaricus、L. plantarum和乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis ssp. lactis）為酸牦牛奶中的優(yōu)勢(shì)菌群。Bao Qiuhua等[25]對(duì)甘肅省甘南地區(qū)酸牦牛奶樣品中乳酸菌多樣性進(jìn)行分析，指出S. thermophilus、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides）和L. helveticus為甘南地區(qū)酸牦牛奶的優(yōu)勢(shì)菌群。這一結(jié)果與本研究存在不同，本研究從青海、甘肅采集的樣品中未分離出S. thermophilus，可能是由于酸牦牛奶發(fā)酵時(shí)間以及采樣季節(jié)和采樣點(diǎn)不同造成的。

2.2 乳酸菌亞硝酸鹽降解能力分析

2.2.1 不同來源乳酸菌亞硝酸鹽降解率頻數(shù)統(tǒng)計(jì)

對(duì)275 株乳酸菌亞硝酸鹽降解率進(jìn)行頻數(shù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表2所示，從總體菌株來看，亞硝酸鹽降解率范圍為4.8%～99.9%，幾何均值為77.3%，其中僅25%的菌株亞硝酸鹽降解率在74%以下，50%的菌株亞硝酸鹽降解率在91.3%以下，8 株菌亞硝酸鹽降解率達(dá)到99.9%，分離菌株表現(xiàn)出較好的亞硝酸鹽降解能力。不同地區(qū)、不同發(fā)酵乳品中的乳酸菌在降解率范圍和幾何均值上均具有顯著差異，其中西藏地區(qū)和奶渣中的乳酸菌顯示了最高的亞硝酸鹽降解率。

表2 不同來源乳酸菌亞硝酸鹽降解率頻數(shù)統(tǒng)計(jì)Table2 Frequency statistics for nitrite degradation rate of LAB isolated from different sources

2.2.2 不同種類優(yōu)勢(shì)乳酸菌亞硝酸鹽降解率頻數(shù)統(tǒng)計(jì)

本研究中菌株數(shù)量大于6的乳酸菌種類共有8 種，對(duì)8 種優(yōu)勢(shì)乳酸菌亞硝酸鹽降解率進(jìn)行頻數(shù)統(tǒng)計(jì)，如表3所示，降解能力因乳酸菌種類不同存在差異性，不同優(yōu)勢(shì)菌種降解率范圍和幾何均值差異明顯，其中L. breris、L. plantarum、L. paracasei顯示了穩(wěn)定高效的降解能力，且L. plantarum降解能力最強(qiáng)，L. fermentum降解能力最差。

表3 不同種類優(yōu)勢(shì)乳酸菌降解亞硝酸鹽頻數(shù)統(tǒng)計(jì)Table3 Frequency statistics for nitrite degradation rate of different dominant LAB

2.2.3 不同地區(qū)發(fā)酵乳品中乳酸菌亞硝酸鹽降解能力比較

將青海、甘肅、新疆、內(nèi)蒙古、西藏5 地發(fā)酵乳品中乳酸菌亞硝酸鹽降解率進(jìn)行方差分析，比較不同地區(qū)菌株在降解能力上的差異。如圖1所示，不同地區(qū)菌株降解能力存在顯著性差異（P＜0.05），來源于西藏的菌株降解能力顯著高于青海、甘肅、新疆的菌株（P＜0.05）；來源于內(nèi)蒙古的菌株與青海、甘肅、新疆、西藏的菌株降解能力差異不顯著（P＞0.05）。不同地區(qū)發(fā)酵乳品由于海拔、溫度、氣候、季節(jié)以及牧民的生活習(xí)慣等因素使其存在著復(fù)雜多樣的菌群微生態(tài)結(jié)構(gòu)[26]，具有特定的優(yōu)勢(shì)乳酸菌類群，優(yōu)勢(shì)菌群之間互相影響，使得不同發(fā)酵乳品中乳酸菌的豐度存在差異，從而可能導(dǎo)致乳酸菌降解亞硝酸鹽特性之間的差異。乳酸菌的遺傳多樣性與其分離地之間也存在直接關(guān)系，遺傳多樣性使得乳酸菌表達(dá)出不同的性狀，具體表現(xiàn)在其降解亞硝酸鹽特性的差異。Song Yuqin等[27]利用多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）技術(shù)對(duì)中國(guó)、俄羅斯及蒙古國(guó)等地的傳統(tǒng)發(fā)酵乳品中L. delbrueckii ssp.bulgaricus進(jìn)行微進(jìn)化分析，研究發(fā)現(xiàn)每個(gè)地區(qū)乳酸菌都有屬于其獨(dú)特的基因型，證實(shí)了乳酸菌會(huì)因?yàn)檫m應(yīng)環(huán)境而發(fā)生某種特定進(jìn)化的假說，從而解釋了乳酸菌降解亞硝酸鹽特性因地區(qū)不同而存在差異的推論。

圖1 不同地區(qū)乳酸菌亞硝酸鹽降解率比較Fig.1 Comparison of nitrite degradation rate among LAB from different regions

2.2.4 不同發(fā)酵乳品中乳酸菌亞硝酸鹽降解能力比較

將酸牦牛奶、酸馬奶、酸駝奶、奶渣4 種發(fā)酵乳品中乳酸菌亞硝酸鹽降解率進(jìn)行方差分析，分析不同發(fā)酵乳品中乳酸菌在降解能力上的差異。如圖2所示，不同發(fā)酵乳品中乳酸菌的降解能力存在顯著性差異（P＜0.05），來源于奶渣中的菌株降解能力顯著高于酸牦牛奶和酸馬奶中的菌株（P＜0.05），而來源于酸駝奶中的菌株降解能力與酸牦牛奶、酸馬奶、奶渣中的菌株差異不顯著（P＞0.05）。不同發(fā)酵乳品中乳酸菌降解能力存在差異，可能是由于牦牛、馬、駱駝各物種之間以及各自生存條件的不同，導(dǎo)致其乳中干物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分存在差異，使得乳中乳酸菌群落結(jié)構(gòu)和所表達(dá)出的降解亞硝酸鹽特性不同。Sun Zhihong等[28]采用MLST技術(shù)對(duì)分離自我國(guó)和蒙古國(guó)的L. helveticus遺傳多樣性進(jìn)行了系統(tǒng)分析，指出菌株的聚類與乳源有關(guān)，即酸馬奶、酸牛奶和酸牦牛奶中分離出的乳酸菌形成單獨(dú)的類群，且存在各自對(duì)應(yīng)的祖先群體，顯示出分離菌株為適應(yīng)特定的生存環(huán)境而發(fā)生某種進(jìn)化的歷程。除此之外，乳的發(fā)酵前處理以及發(fā)酵乳的制作方式不同也會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵乳中乳酸菌群落結(jié)構(gòu)和特性的差異。

圖2 不同發(fā)酵乳品中乳酸菌亞硝酸鹽降解率比較Fig.2 Comparison of nitrite degradation rate among LAB from different fermented milk products

2.2.5 不同種類乳酸菌亞硝酸鹽降解能力比較

圖3 不同種類優(yōu)勢(shì)乳酸菌亞硝酸鹽降解率比較Fig.3 Comparison of nitrite degradation rate among different dominant LAB

對(duì)8 種優(yōu)勢(shì)乳酸菌亞硝酸鹽降解率進(jìn)行方差分析，分析不同優(yōu)勢(shì)菌種在降解能力上的差異，如圖3所示，8 種不同優(yōu)勢(shì)菌株之間降解能力存在顯著性差異（P＜0.05）。優(yōu)勢(shì)菌種中L. plantarum降解率最高，而L. fermentum降解率最低。通過分析可以發(fā)現(xiàn)L. breris、L. plantarum、L. paracasei、L. kef i ranofaciens、L. casei與L. fermentum、L. helveticus的降解能力相比有顯著性差異（P＜0.05）；L. delbrueckii ssp. bulgaricus與L. breris、L. casei、L. plantarum、L. paracasei、L. kef i ranofaciens、L. fermentum的降解能力相比有顯著性差異（P＜0.05）。不同菌種在降解能力上的差異可能是由于不同種乳酸菌在降解亞硝酸鹽基因水平上的不穩(wěn)定，導(dǎo)致其表達(dá)亞硝酸鹽降解能力的差異。菌種自身所具有的特性間可能存在相互影響，張慶芳等[29]認(rèn)為，乳酸菌降解亞硝酸鹽主要分為酶降解和酸降解兩個(gè)階段。乳酸菌發(fā)酵前期，pH值大于4.5時(shí)以酶降解為主，到了發(fā)酵后期pH值小于4.0時(shí)，以酸降解為主，故不同種乳酸菌產(chǎn)酸能力、產(chǎn)亞硝酸還原酶能力的不同也是導(dǎo)致其亞硝酸鹽降解能力不同的原因之一。乳在發(fā)酵過程中硝酸還原菌可將硝酸鹽轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽，導(dǎo)致發(fā)酵乳品中的亞硝酸鹽含量超標(biāo)，而乳酸菌具有抑制硝酸還原菌生長(zhǎng)的作用，且不同種乳酸菌所具備抑制硝酸還原菌生長(zhǎng)作用的差異較大，也可造成發(fā)酵乳中亞硝酸鹽含量的不同[30]。

3 結(jié) 論

從青海、甘肅、新疆、內(nèi)蒙古、西藏5地104 份傳統(tǒng)發(fā)酵乳品中共分離得到275 株乳酸菌，鑒定出6 個(gè)屬23 個(gè)種。通過比較分析發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)、不同發(fā)酵乳品中存在著復(fù)雜多樣的乳酸菌菌群微生態(tài)結(jié)構(gòu)。其中L. helveticus為青海、甘肅、新疆、內(nèi)蒙古、西藏5 個(gè)地區(qū)發(fā)酵乳品中共有菌株。L. helveticus和L. plantarum為酸牦牛奶、酸馬奶、酸駝奶、奶渣4 種傳統(tǒng)發(fā)酵乳品中共有菌株。以菌株篩分率為基準(zhǔn)，青海發(fā)酵乳品中優(yōu)勢(shì)菌為L(zhǎng). helveticus和L. delbrueckii ssp. bulgaricus；新疆和甘肅發(fā)酵乳品中優(yōu)勢(shì)菌均為L(zhǎng). helveticus；內(nèi)蒙古發(fā)酵乳品中優(yōu)勢(shì)菌為L(zhǎng). kefiranofaciens和L. helveticus；西藏發(fā)酵乳品中優(yōu)勢(shì)菌為L(zhǎng). breris、L. plantarum、L. casei和L. paracasei。酸牦牛奶中優(yōu)勢(shì)菌為L(zhǎng). helveticus和L. delbrueckii ssp. bulgaricus；酸馬奶和酸駝奶中優(yōu)勢(shì)菌均為L(zhǎng). kefiranofaciens和L. helveticus；奶渣中優(yōu)勢(shì)菌為L(zhǎng). breris、L. plantarum、L. casei和L. paracasei。

對(duì)分離出的275 株乳酸菌亞硝酸鹽降解能力進(jìn)行分析，菌株降解率在4.8%～99.9%之間波動(dòng)，50%的菌株表現(xiàn)出較好的降解能力，降解率平均在91.3%以上，其中8 株菌的降解率達(dá)到99.9%。

降解能力因菌株來源和乳酸菌種類不同存在差異性，來源于西藏的菌株降解能力顯著高于青海、甘肅、新疆的菌株（P＜0.05），來源于奶渣中的菌株降解能力顯著高于酸牦牛奶和酸馬奶中的菌株（P＜0.05）；優(yōu)勢(shì)菌種中L. plantarum、L. paracasei、L. breris顯示了穩(wěn)定高效的降解能力，且L. plantarum降解能力最強(qiáng)，其中L. breris、L. casei、L. plantarum、L. paracasei、L. kefiranofaciens與L. fermentum、L. helveticus、L.delbrueckii subsp. bulgaricus之間相互比較，部分菌株間存在顯著性差異（P＜0.05）。