于美娟，楊 慧，譚 歡，劉學(xué)文，馬美湖，李高陽

（1.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南 長沙 410125；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

我國淡水魚資源豐富，2015年我國淡水產(chǎn)品產(chǎn)量3 290萬 t，同比增長3.94%。其中用于加工的淡水產(chǎn)品561.9萬 t，占加工水產(chǎn)品總量的24.7%[1]。伴隨著加工業(yè)的進(jìn)步，淡水產(chǎn)品加工比率的增長超過海水[2]。在淡水魚眾多加工產(chǎn)品中，固態(tài)發(fā)酵魚制品是一類能提供優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源、深受人們喜愛的傳統(tǒng)發(fā)酵食品。魚固態(tài)發(fā)酵也是熱帶或亞熱帶地區(qū)的人民為了在高溫、高濕度條件下保存魚肉的一種方式，在日本、東南亞和非洲等地常見這種產(chǎn)品銷售[3-5]。我國傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵魚制品因地域、民族、加工方式不同而產(chǎn)生口味各異的品種。

傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵魚制品主要采用傳統(tǒng)的自然發(fā)酵制作，發(fā)酵時(shí)間長，發(fā)酵條件難以控制，只能在秋末、冬季生產(chǎn)。為縮短發(fā)酵時(shí)間，防止產(chǎn)品的隨機(jī)性，國內(nèi)不少學(xué)者對定向分離篩選、接種發(fā)酵進(jìn)行了研究探討[6-9]，但得到的產(chǎn)品口感不如傳統(tǒng)加工的產(chǎn)品。因?yàn)閭鹘y(tǒng)固態(tài)發(fā)酵魚制品屬自然發(fā)酵，微生物組成復(fù)雜多樣[10]。微生物菌群結(jié)構(gòu)往往也對產(chǎn)品的色澤、質(zhì)構(gòu)、質(zhì)量安全等起著至關(guān)重要的作用[11]。同時(shí)，在發(fā)酵過程中，伴隨著菌體生物量的增加，蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物等生物大分子化合降解成小分子代謝產(chǎn)物，對最終風(fēng)味品質(zhì)的形成產(chǎn)生直接作用[12]。因此，了解發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)動態(tài)是調(diào)控和提升產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵。

國內(nèi)對發(fā)酵魚肉中微生物的動態(tài)研究較少，而且主要以傳統(tǒng)培養(yǎng)和克隆分析進(jìn)行探討[8,10]，但這些方法在探討微生物數(shù)量和動態(tài)變化上是有限的，不能完全反映整個(gè)微生物多樣性的真實(shí)狀態(tài)。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，第2代高通量測序技術(shù)能夠全面而準(zhǔn)確、直接地反映微生物的群落構(gòu)成、功能特性、變化演替和多樣性，而且具有檢測通量更高、用時(shí)更少的優(yōu)點(diǎn)[13]，避開了微生物培養(yǎng)法的局限性和其DGGE/TGGE等非培養(yǎng)技術(shù)耗時(shí)、檢測費(fèi)用高等問題。目前在其他發(fā)酵食品的微生物生態(tài)學(xué)上得到應(yīng)用[14-17]，筆者也應(yīng)用此方法揭示了不同工藝傳統(tǒng)發(fā)酵魚的微生物多樣性及品質(zhì)特征差異[18]。但是運(yùn)用高通量測序技術(shù)并結(jié)合質(zhì)構(gòu)儀、氨基酸自動分析儀和氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀分析傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵魚發(fā)酵過程中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)動態(tài)演變及品質(zhì)特征變化還鮮見報(bào)道。

本研究擬取同條件下發(fā)酵0～180 d的傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵鲊魚樣品，采用溴化十六烷三甲銨（cetyltrimenthyl ammonium bromide，CTAB）法提取總細(xì)菌DNA，根據(jù)所擴(kuò)增的16S rDNA區(qū)域特點(diǎn)，基于Illumina HiSeq高通量測序平臺雙末端測序，揭示其發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化，同時(shí)結(jié)合質(zhì)構(gòu)分析儀、全自動氨基酸分析儀、GC-MS等分析手段，提示其發(fā)酵過程中質(zhì)構(gòu)變化、氨基酸組分的降解、脂肪酸組分的降解及與時(shí)間的相關(guān)性，進(jìn)一步加深對傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵鲊魚發(fā)酵機(jī)制的認(rèn)識，較全面地掌握發(fā)酵過程，從而為利用微生物資源、改善傳統(tǒng)發(fā)酵工藝和控制產(chǎn)品質(zhì)量安全提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮草魚購于湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生鮮農(nóng)貿(mào)市場；調(diào)味料、香辛料購于大型超市。

17 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 美國Sigma公司；DNA凝膠回收試劑盒 德國Qiagen公司；TruSeq文庫構(gòu)建試劑盒、MiSeq測序試劑盒 美國Illumina公司；溶菌酶美國BBI公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890-5975C GC-MS聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；L-8900全自動氨基酸分析儀 日本日立公司；CT3質(zhì)構(gòu)儀 美國Brookf i eld公司；Illumina HiSeq測序儀 美國Illumina公司；Flx800酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；AL204電子天平 美國Mettler-Toledo公司；101-1AB電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；FJ200高速分散勻質(zhì)機(jī) 上海圣科儀器設(shè)備有限公司；Avanti J-26XP高效冷凍離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制作與采集

取2～4 kg的大小草魚15 條，去內(nèi)臟、骨，切塊，每100 g魚肉加入2～3 g食鹽，低溫5～10 ℃腌制12 h，烘箱40 ℃條件下烘至魚塊含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%～45%，然后加香辛料裝壇密封，20 ℃左右發(fā)酵，發(fā)酵0、10、20、30、50、70、90、120、150、180 d取樣，樣品一式3 份，每份1 kg。每份樣品取100 g置于-80 ℃冰箱保存用于高能量測序等，質(zhì)構(gòu)直接取樣測定，其余樣品置于-20 ℃冰箱保存。

1.3.2 DNA提取、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增及高通量測序分析

DNA提?。喝悠犯?0.00 g加入至100 mL滅菌生理鹽水中，均質(zhì)拍打2 min后，至4 ℃搖床30 min，靜置10 min，取上清液離心后采用CTAB方法對樣本的基因組DNA進(jìn)行提取[19]。之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，檢測合格后將3 份平行樣品的DNA合并混合均勻備用。

PCR擴(kuò)增及測序：所有樣品的細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)擴(kuò)增用引物515F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’）和引物806R（5’-GGACTAHVGGGTWTCTAAT-3’）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用Illmina Miseq PE250測序平臺進(jìn)行高通量測序（北京諾禾致源生物科技有限公司）。

數(shù)據(jù)分析：利用Uparse軟件[20]對所有樣品的全部Effective Tags進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），用RDP Classif i er[21]方法與GreenGene數(shù)據(jù)庫[22]進(jìn)行物種注釋分析，用Qiime軟件（Version 1.7.0）對Chao1、Shannon多樣性指數(shù)和Goods Coverage指數(shù)進(jìn)行計(jì)算。

1.3.3 質(zhì)構(gòu)分析

采用物性測試儀CT3測定發(fā)酵后鲊魚樣品的硬度、黏性、彈性、咀嚼性等。分別取不同發(fā)酵時(shí)間段的鲊魚塊，將其切成10 mm×20 mm×20 mm的方塊，在室溫下進(jìn)行物性測試。測試條件為：探頭TA44，目標(biāo)2 mm，觸發(fā)點(diǎn)負(fù)荷30.0 g，預(yù)測試速率2 mm/s，測試速率2 mm/s，返回速率2 mm/s，數(shù)據(jù)頻率20 點(diǎn)/秒，循環(huán)次數(shù)2。每個(gè)樣品進(jìn)行6 次以上的測試，結(jié)果取 ±s。

1.3.4 氨基酸組分分析

參考李春萍[23]的方法并略作修改：準(zhǔn)確稱取樣品0.500 0 g于酸解管中，加入10 mL6 mol/L鹽酸溶液，抽真空密封，于110 ℃水解24 h。水解結(jié)束后超純水定容至50 mL，用定性濾紙過濾，吸取1 mL于20 mL燒杯中真空干燥1 h，加入0.02 mol/L鹽酸溶液10 mL，過0.22 μm水系濾膜，采用全自動氨基酸分析儀測定。

1.3.5 脂肪酸組分分析

脂肪酸的提取和甲酯化參照GB/T 9695.2—2008《肉與肉制品 脂肪酸測定》，使用GC-MS測定，用峰面積歸一法確定各種脂肪酸的相對含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010、Origin 9.1、SPSS Statistics 20.0等統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中細(xì)菌多樣性變化

表1 不同發(fā)酵時(shí)間傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵鲊魚樣品序列信息和注釋統(tǒng)計(jì)分析Table1 Summary of the sequencing data sets and statistical analysis of solid-state fermented Zhayu samples

對傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵鲊魚不同發(fā)酵時(shí)間的樣本提取總細(xì)菌DNA，經(jīng)過一系列處理后運(yùn)用Illumina Hiseq PE250平臺進(jìn)行測序分析，結(jié)果如表1所示，共得到568 114 條有效序列，平均每個(gè)樣品含有56 811 條序列（48 997～63 019條），有效序列越多，進(jìn)入分類的序列（Taxon Tags）也越多。獨(dú)特序列（Unique Tags）除發(fā)酵0～10 d樣品在2 000以上外，其他時(shí)間段的樣品大致多在200～300之間。另外，各樣品的Goods Coverage指數(shù)均在0.995以上，說明本實(shí)驗(yàn)的測序量已經(jīng)達(dá)到飽和，測序結(jié)果基本能夠反映傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵鲊魚發(fā)酵過程中微生物菌群多樣性組成，測序深度已基本覆蓋樣品中所有微生物，更多的數(shù)據(jù)量對發(fā)現(xiàn)新的OTUs的邊際貢獻(xiàn)很小。

微生物菌群生態(tài)學(xué)可通過樣品的OTUs、Chaol和Shannon等多樣性指標(biāo)來反映微生物群落的豐度和多樣性。OTUs數(shù)值越大表示物種多樣性越豐富；Chaol數(shù)值越大，則表示樣品復(fù)雜度越高；Shannon數(shù)值越大，則表示該樣品中的物種越豐富。從表1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，樣品中的細(xì)菌多樣性總體呈現(xiàn)迅速下降然后緩慢上升再下降的趨勢。如在發(fā)酵初期（0～10 d），OTUs值在1 383～1 445之間，Shannon為4.421～5.124，Chaol為1 406.264～1 407.000，表明樣品中初始細(xì)菌物種豐富、種類繁雜。但在發(fā)酵10～20 d期間，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，細(xì)菌種類下降明顯，OTUs值從1 383降至436，Shannon從4.421降至1.549，Chaol從1 406.264降至417.75。而在發(fā)酵20～180 d，其OTUs值、Chaol、Shannon等多樣性指數(shù)上升和下降浮動趨勢不大，表明能夠適應(yīng)新生長環(huán)境的微生物數(shù)量逐漸處于平穩(wěn)。

2.2 發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化

根據(jù)RDP數(shù)據(jù)庫同源性序列比對與聚類相結(jié)合的方法對序列進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)所有樣品中可以確認(rèn)的有10 個(gè)門類群、30 個(gè)綱類群、60 個(gè)目類群、90 個(gè)科類群、130 個(gè)屬類群。

圖1 門水平上的物種相對豐度Fig.1 Phylum-level community structure of bacteria in Zhayu

如圖1所示，在發(fā)酵0～180 d期間，各階段的發(fā)酵鲊魚所含細(xì)菌門水平類基本相似，主要有厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、泉古菌門（Crenarchaeota）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）、酸桿菌門（A c i d o b a c t e r i a）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）10 個(gè)門類。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度值整體顯增加的趨勢，在發(fā)酵的整個(gè)階段占有絕對優(yōu)勢，與朱雯娟[24]分析發(fā)酵梅香魚中微生物種群的結(jié)果一致；變形菌門（Proteobacteria）在發(fā)酵初期，下降緩慢，發(fā)酵10～20 d，相對豐度值迅速下降，之后又慢慢回升，顯波浪形變化；其他幾個(gè)菌門隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，逐漸減少，而且減少的速率比較明顯，有的接近于零。

如圖2所示，相對豐度排名前10的有芽孢桿菌目（Bacillales）、腸桿菌目（Enterobacteriales）、乳酸桿菌目（Lactobacillales）、餐古菌目（Cenarchaeales）、假單胞菌目（Pseudomonadales）、海洋螺菌目（Oceanospirillales）、黃單胞菌目（Xanthomonadales）、紅細(xì)菌目（R h o d o b a c t e r a l e s）、酸微菌目（Acidimicrobiales）、紅螺菌目（Rhodospirillales）。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，細(xì)菌的多樣性逐漸減少，主要以芽孢桿菌目為主，其相對豐度值呈增加趨勢；其次是乳酸桿菌目，相對豐度值上下波動，不穩(wěn)定；但值得注意的是，在發(fā)酵70 d和120 d階段，腸桿菌目相對豐度值有明顯上升趨勢，原因有待于下一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

圖2 目水平上的物種相對豐度Fig.2 Order-level community structure of bacteria in Zhayu

圖3 科水平上的物種相對豐度Fig.3 Family-level community structure of bacteria in Zhayu

為進(jìn)一步對不同發(fā)酵階段微生物菌群結(jié)構(gòu)的動態(tài)進(jìn)行分析，更深入地了解發(fā)酵時(shí)間對細(xì)菌組成和數(shù)量的影響情況，在科水平對其相對豐度排名靠前的進(jìn)行歸類，如圖3所示，其菌屬的動態(tài)變化如下：在發(fā)酵初期（0～10 d），細(xì)菌群落多樣性豐富，相對豐度大于0.1%的科水平達(dá)40多個(gè)，其優(yōu)勢為葡葡萄球菌科（Staphylococcaceae）（48%）、腸球菌科（Enterococcaceae）（9.46%）、餐古菌科（Cenarchaeaceae）（5.57%）、紅細(xì)菌科（Rhodobacteraceae）（2.12%）。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長（10～50 d），因大部分葡萄球菌具有蛋白酶活性，降解蛋白成小分子肽和游離氨基酸，為乳酸類細(xì)菌的生長繁殖提供了營養(yǎng)因子[25]，使一些細(xì)菌迅速增長，芽孢桿菌科（Bacillaceae）相對豐度值由0.017%上升為1.35%、乳桿菌科（Lactobacillaceae）由0.018%上升為0.88%、明串珠菌科（Leuconostocaceae）由0.0%上升為0.61%、鏈球菌科（Streptococcaceae）由0.002%上升為0.32%、莫拉菌科（Moraxellaceae）由0.006%上升為0.31%；而黃桿菌科（Flavobacteriaceae）、海洋螺菌科（Oceanospirillaceae）、假交替單胞菌科（Pseudoalteromonadaceae）、交替單胞菌科（Alteromonadaceae）等卻隨著發(fā)酵時(shí)間的延長快速下降，餐古菌科（Cenarchaeaceae）下降為0%，其優(yōu)勢菌轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸亚蚓?、腸球菌和乳酸類細(xì)菌。發(fā)酵70～180 d，乳酸類細(xì)菌的相對豐度值下降，葡萄球菌上升，但是應(yīng)引起重視的是隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，腸桿菌也慢慢生長起來，與目水平相似。

2.3 發(fā)酵過程中質(zhì)構(gòu)變化

從表2可知，在發(fā)酵0～10 d，除黏性外，各指標(biāo)差異不顯著（P＞0.05），在發(fā)酵10～120 d之間，硬度、膠著性、咀嚼性差異顯著（P＜0.05），數(shù)值下降明顯。在120～150 d，除黏性外，各指標(biāo)數(shù)值保持相近，沒有差異（P＞0.05），在150～180 d，各指標(biāo)差異顯著（P＜0.05）。并且時(shí)間與質(zhì)構(gòu)指標(biāo)在0.01水平（雙側(cè)）上除黏性沒有相關(guān)性外，其他都存在顯著負(fù)相關(guān)。這是因?yàn)轸~制品在發(fā)酵過程中往往伴隨著一系列復(fù)雜的生理生化變化，隨著發(fā)酵時(shí)間的延續(xù)，魚肉中微生物的蛋白酶和脂肪酶活性以及魚肉的自身酶活性能使大分子的蛋白質(zhì)和脂肪降解為小分子的肽、氨基酸和游離脂肪酸等化合物，這些生化變化除了形成產(chǎn)品獨(dú)特的風(fēng)味外，同時(shí)也導(dǎo)致了發(fā)酵魚制品質(zhì)構(gòu)疏松，組織松軟[26]。

表2 固態(tài)發(fā)酵鲊魚在發(fā)酵過程中質(zhì)構(gòu)的變化Table2 Changes in texture prof i le of Zhayu during fermentation

2.4 發(fā)酵過程中氨基酸組分變化

氨基酸是傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵鲊魚中主要的代謝產(chǎn)物，從表3可知，在不同發(fā)酵時(shí)間段，17 種氨基酸含量總的變化趨勢是先升后降，其主要氨基酸為谷氨酸、賴氨酸、亮氨酸和天冬氨酸。而且各氨基酸組分與時(shí)間的相關(guān)系數(shù)在0.01水平（雙側(cè)）上除胱氨酸沒有顯著相關(guān)性外，其他都存在顯著負(fù)相關(guān)。主要原因是在發(fā)酵起始階段，在微生物蛋白酶的作用下，大分子蛋白降解成多肽以及氨基酸分子，從而氨基酸含量增加，而后期進(jìn)一步降解，參與風(fēng)味物質(zhì)的形成以及生成小分子含氮化合物，從而氨基酸含量降低[27-28]。根據(jù)氨基酸的顯味特征，分為鮮味、甜味和苦味氨基酸，其中鮮味和甜味氨基酸含量之和大于苦味氨基酸的量。

表3 固態(tài)發(fā)酵鲊魚發(fā)酵過程中氨基酸含量的變化Table3 Changes in amino acid contents of Zhayu during fermentation

表4 傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵鲊魚發(fā)酵過程中脂肪酸的組成和變化（以脂肪酸甲酯計(jì)的峰面積相對含量）Table4 Change in fatty acid composition of Zhayu during fermentation

2.5 發(fā)酵過程中脂肪酸組成變化

由表4可知，鲊魚在發(fā)酵過程中于共檢出23 種脂肪酸：飽和脂肪酸9 種，單不飽和脂肪酸6 種和多不飽和脂肪酸8 種。飽和脂肪酸中棕櫚酸（C16:0）和硬脂酸（C18:0） 的含量較高，飽和脂肪酸總含量與發(fā)酵時(shí)間在0.01水平（雙側(cè)）存顯著負(fù)相關(guān)。單不飽和脂肪酸中以棕櫚油酸（C16:1n7）和油酸（C18:1n9）為主，相對含量與發(fā)酵時(shí)間顯負(fù)相關(guān)。多不飽和脂肪酸中以亞油酸（C18:2n6）、亞麻酸（C18:2n6）和花生四烯酸（C20:4n6）為主，其相對含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，呈增加趨勢，這與李春萍[23]在臭鱖魚發(fā)酵中分析單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的結(jié)果一致。不飽和脂肪酸對人體有益，有研究表明，油酸和亞油酸能抑制膽固醇在小腸中的吸收，促進(jìn)肝臟內(nèi)膽固醇的降解和排除，改變體內(nèi)膽固醇的分布[29]。從3 種脂肪酸所占的比例來看，不飽和脂肪酸的比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于飽和脂肪酸的比例，這有利于抑制不飽和脂肪酸的氧化酸敗。

3 討 論

3.1 發(fā)酵過程中細(xì)菌多樣性和群落變化與品質(zhì)的關(guān)系

與傳統(tǒng)方法比，本研究采用Illumina HiSeq平臺測序得到微生物種類更多，更能接近于樣品的微生態(tài)，其共測出10 個(gè)門類、30 個(gè)綱類群、60 個(gè)目類群、90 個(gè)科類群、130 個(gè)屬類群。在整個(gè)發(fā)酵過程中，主要以厚壁門為主。發(fā)酵初期，在科水平相對豐度值排前的是葡萄球菌科和腸球菌科，其歸屬于厚壁門也占優(yōu)勢地位；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長（10～50 d），乳桿菌、魏斯氏菌、明串珠菌、鏈球菌、四聯(lián)球菌顯著上升，而淡水魚中最常見的細(xì)菌種類，如海洋中螺菌屬、假單胞菌屬、弧菌屬、黃桿菌屬、莫拉克斯氏菌屬等卻隨著發(fā)酵時(shí)間的延長快速下降，其主要優(yōu)勢菌為葡萄球菌、腸球菌和乳酸類細(xì)菌。但是發(fā)酵70 d后，有部分腐敗菌，如特布爾西式菌屬、埃希氏菌屬等腸桿菌科有緩慢生長的趨勢。這說明發(fā)酵過程中微生物菌群結(jié)構(gòu)隨時(shí)間推移存在一個(gè)動態(tài)變化。

同樣通過高通量Illumina平臺測序分析發(fā)酵魚制品中細(xì)菌結(jié)構(gòu)，本研究結(jié)果與其朱雯娟[24]測定梅香魚和蔡瑞康[30]測定糟制大黃魚中細(xì)菌菌群有一定的異同點(diǎn)。本研究通過Illumina平臺測序，發(fā)酵初期，科水平相對豐度值排前的是葡萄球菌科和腸球菌科；發(fā)酵10～50 d，其主要優(yōu)勢菌為葡萄球菌、腸球菌和乳酸類細(xì)菌。發(fā)酵70 d后，腸桿菌科有緩慢生長的趨勢。而朱雯娟[24]對梅香魚 的Illumina測序，得出細(xì)菌共有8 個(gè)門，其中優(yōu)勢菌門是厚壁菌門。在厚壁菌門中，相對豐度值最高的菌屬分別是乳桿菌屬（25.36%）、葡萄球菌屬（19.27%）和四聯(lián)球菌屬（14.62%），可被認(rèn)為是參與發(fā)酵過程的優(yōu)勢菌屬。蔡瑞康[30]采用Illumina測序?qū)Υ簏S魚糟制過程中細(xì)菌，得出糟制前期的優(yōu)勢菌為芽孢桿菌屬、弧菌屬和涅瓦菌屬；隨著糟制時(shí)間的延長芽孢桿菌屬比例逐漸下降，弧菌屬比例先上升后大幅下降，而前期比例較小的魏斯氏菌屬、乳桿菌屬和腸球菌比例逐漸增加成為優(yōu)勢菌，糟制后期優(yōu)勢菌為魏斯氏菌屬，涅瓦菌屬、芽孢桿菌屬和乳桿菌屬。有研究表明，發(fā)酵產(chǎn)品中優(yōu)勢微生物的種類和數(shù)量差異可能是由于食物基質(zhì)的組成和發(fā)酵參數(shù)不同[31]，上述3 種不同發(fā)酵魚制品的差異正好證明這一觀點(diǎn)。

在本研究高通量測序中，葡萄球菌、乳酸菌是主要的優(yōu)勢菌。有研究表明，葡萄球菌不僅對產(chǎn)品色澤有貢獻(xiàn)[32]；而且葡萄球菌還有降解生物胺的能力，如木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）不僅能夠大幅度地降解組胺，還具有良好的降解酪胺的能力[33]。乳酸菌可將氨基酸在轉(zhuǎn)氨酶作用下轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的α-酮酸，而α-酮酸則可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為酸類、醇類化合物[34]；從發(fā)酵魚中分離的乳酸菌還能有效抑腐敗菌[35]。這表明，在傳統(tǒng)發(fā)酵魚的發(fā)酵過程中，優(yōu)勢益生菌活動對產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)具有直接的影響。

在本研究高通量測序中，腸球菌在各個(gè)時(shí)期都保持著較高的相對豐度，是人類和動物腸道中正常的菌群。腸球菌中某些種如海氏腸球菌、糞腸球菌和尿腸球菌等因具有良好的生物安全性和優(yōu)良的益生特性，常作為益生菌被應(yīng)用于發(fā)酵食品的生產(chǎn)[36]。雖然高相對豐度值的桿腸菌科是腸道細(xì)菌中常見的條件致病菌，但由于部分種群與致病菌沙門菌十分相似，故對其進(jìn)行分類鑒定非常重要。另外其他占有比例比較少的菌群，對整個(gè)產(chǎn)品的風(fēng)味是否有影響，還需在以后的實(shí)驗(yàn)中加以驗(yàn)證。

3.2 發(fā)酵過程中質(zhì)構(gòu)變化與品質(zhì)的關(guān)系

魚制品在發(fā)酵過程中由于魚肉體中自身酶、添加的鹽及其他輔料及微生物酶的共同作用，發(fā)生一系列復(fù)雜的生理生化變化，從而也導(dǎo)致了發(fā)酵魚制品的質(zhì)構(gòu)發(fā)生改變，使得質(zhì)構(gòu)疏松，組織松軟。本研究用質(zhì)構(gòu)分析儀測定了不同發(fā)酵時(shí)期鲊魚的質(zhì)構(gòu)指標(biāo)，不僅能消除人為和個(gè)人感官的主觀性影響，而且還能對樣品的質(zhì)構(gòu)特性做出準(zhǔn)確的定量表述。如表3所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，硬度、內(nèi)聚性、彈性、膠著性、咀嚼性等質(zhì)構(gòu)指標(biāo)數(shù)值顯下降趨勢，與時(shí)間存在顯著負(fù)相關(guān)（在0.01水平，雙側(cè)），隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，其質(zhì)構(gòu)指標(biāo)的如硬度、咀嚼性等指標(biāo)的下降，從而影響了產(chǎn)品的口感品質(zhì)。

3.3 發(fā)酵過程中氨基酸組分的變化與品質(zhì)的關(guān)系

氨基酸是發(fā)酵魚制品中主要的代謝產(chǎn)物，與滋味、風(fēng)味密切相關(guān)，有研究表明，天冬氨酸、谷氨酸與甘氨酸、丙氨酸的含量決定了魚肉的鮮味[37]。在發(fā)酵過程中，引起氨基酸含量變化的主要因素有：一方面為魚自身酶和微生物蛋白酶的作用下發(fā)生一系列生化變化，如李改燕等[10]在糟魚加工中發(fā)現(xiàn)，在蛋白酶的作用下，先增加的氨基氮經(jīng)進(jìn)一步降解，參與風(fēng)味物質(zhì)的形成以及生成小分子含氮化合物，而使氨基態(tài)氮含量降低；Córdoba等[28]發(fā)現(xiàn)在火腿加工后期，精氨酸、天冬氨酸這些氨基酸因參與美拉德反應(yīng)而使含量下降。另一方面，食鹽的添加使魚體內(nèi)一部分氨基酸等物質(zhì)經(jīng)滲透遷移，如陳學(xué)云等[38]在糟制帶魚加工中發(fā)現(xiàn)由于滲透作用，氨基氮含量下降，多肽氮下降。綜合酶降解和滲透作用，在本研究傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵鲊魚發(fā)酵過程中，主要以微生物蛋白酶降解為主，也證實(shí)了各組分氨基酸的含量是先增加后減少的趨勢，其中谷氨酸含量最高，賴氨酸、亮氨酸、天冬氨酸次之，絲氨酸、甘氨酸、脯氨酸含量最低。

3.4 發(fā)酵過程中脂肪酸組分的變化與品質(zhì)的關(guān)系

脂肪水解跟蛋白水解一樣被認(rèn)為對產(chǎn)品風(fēng)味的形成起著關(guān)鍵性的作用，其中，中鏈和長鏈的脂肪酸一般是風(fēng)味化合物的前體物質(zhì)，如具有脂肪酶活性的葡萄球菌（S. xylosus、S. carnosus）能降解脂肪，形成大量的醛、酮、醇、烯烴、烷烴等風(fēng)味小分子，從而改善產(chǎn)品的風(fēng)味[39]，而短鏈脂肪酸（C＜6）通常具有濃郁的奶酪味[40]。有研究表明，油酸和亞油酸能抑制膽固醇在小腸中的吸收，促進(jìn)肝臟內(nèi)膽固醇的降解和排除，改變體內(nèi)膽固醇的分布；二十碳五稀酸和二十二碳六稀酸對人體十分有益，能夠降血脂、降血壓、抗血栓、防治動脈粥樣硬化等。本研究得到的脂肪酸主要是以中長鏈為主，具有改善產(chǎn)品整體風(fēng)味的作用；單不飽和脂肪酸中以油酸為主，多不飽和脂肪酸中以亞油酸為主，可抑制對膽固醇的吸收和促進(jìn)膽固醇的降解。