楊勝遠(yuǎn)，韋 錦，曾 嬋，彭羅慧

（1.嶺南師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東 湛江 524048；2.嶺南師范學(xué)院 熱帶與南海資源協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東 湛江 524048；3.嶺南師范學(xué)院圖書館，廣東 湛江 524048）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種具有4 個(gè)碳原子的非蛋白質(zhì)組成氨基酸，為哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有利尿、降血脂、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、降血壓、鎮(zhèn)靜和改善睡眠等作用[1-4]，可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞對抗腫瘤藥奧沙利鉑的敏感性[5]，已成為備受關(guān)注的藥品和保健品成分。由于可以通過內(nèi)酰胺化作用形成2-吡咯烷酮，因此GABA還是生產(chǎn)生物塑料聚酰胺4的重要原料[6-7]。

微生物生長繁殖快，因其生產(chǎn)GABA不受時(shí)間和空間限制，利用微生物谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD，EC4.1.1.15）生產(chǎn)GABA備受關(guān)注[2,8]。GAD是一種依賴于磷酸吡哆醛的裂解酶，存在于細(xì)胞質(zhì)中，是生物體催化L-谷氨酸（L-glutamic acid，L-Glu）發(fā)生α-羧基脫羧作用生成GABA的唯一酶[9]。由于GAD作用的底物（L-Glu）和產(chǎn)物（GABA）均為小分子，可以透過細(xì)胞膜，因此可以直接采用細(xì)胞轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)GABA，減少胞內(nèi)酶的提取成本，簡化生產(chǎn)工藝。已有文獻(xiàn)通過唾液鏈球菌嗜熱亞種[10]、戊糖片球菌[11]、屎腸球菌[12]、短乳桿菌[13]、大腸桿菌[14-15]細(xì)胞轉(zhuǎn)化法制備GABA的報(bào)道。然而，由于微生物GAD活性普遍不高，GABA產(chǎn)量偏低，成本高，難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求。因此，如何提高微生物GAD活性、提高具有高活性GAD細(xì)胞的產(chǎn)量以及通過改善細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系或工藝條件，提高GABA的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，將是今后亟需解決的關(guān)鍵問題。

固體酸是綠色化學(xué)領(lǐng)域一類重要的酸堿催化劑，在綠色化學(xué)催化反應(yīng)中已經(jīng)引起極大的關(guān)注和研究。732陽離子交換樹脂選擇性高，后處理簡便，價(jià)廉易得、不污染環(huán)境、不腐蝕設(shè)備，容易分離及回收，可重復(fù)使用，已廣泛用于物質(zhì)的分離純化。732陽離子交換樹脂在離子交換的過程中，能夠給出質(zhì)子或者接受電子對，因此也可以作為酸堿催化反應(yīng)體系的固體酸。雖然固體酸在綠色化學(xué)領(lǐng)域研究報(bào)道較多，但是在生物酶催化反應(yīng)體系中的應(yīng)用尚鮮見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)在前期對多種固體酸的篩選基礎(chǔ)上，對732陽離子交換樹脂在屎腸球菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)GABA的應(yīng)用條件進(jìn)行了探討，以期為開發(fā)生物合成GABA新工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

屎腸球菌（Enterococcus faecium）LNSF2為嶺南師范學(xué)院綠色生物制造研究室保藏菌株，分離自泡菜。

GABA（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥9 9%）、異硫氰酸苯酯（phenylisothiocyanate，PITC） 美國Sigma公司；乙腈、乙酸、三乙胺（均為色譜純） 美國Tedia公司；732陽離子交換樹脂 廊坊沃恒化工有限公司。

改良PSB培養(yǎng)基為在文獻(xiàn)[16]的PSB培養(yǎng)基基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化，培養(yǎng)基組成為：蛋白胨15 g/L、牛肉膏10 g/L、蔗糖12.5 g/L、乙酸鈉6.0 g/L、谷氨酸一鈉（monosodium glutamate，MSG）10 g/L、吐溫80 1.0 g/L，pH 6.8。將改良PSB培養(yǎng)基分裝于100 mL/250 mL三角瓶，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

1200 Series高效液相色譜儀（配置G1354A四元梯度泵、G1316A柱溫箱、G1314B可變波長紫外檢測器、Chemstation工作站等） 美國安捷倫公司；PSH-200生化培養(yǎng)箱 中科生命科技股份有限公司；Centrifuge 5804R冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；VX-200渦旋混合儀 美國Labnet公司；AUW120電子分析天平 日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

從4 ℃保藏的E. faecium LNSF2斜面挑取1 環(huán)，接入改良PSB培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，然后按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接入改良PSB培養(yǎng)基，于37 ℃靜置培養(yǎng)12 h作為種子液。

1.3.2 E. faecium LNSF2發(fā)酵方法

將E. faecium LNSF2種子液按體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接入改良PSB培養(yǎng)基，于37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，作為發(fā)酵醪。

1.3.3 E. faecium LNSF2菌懸液制備

將發(fā)酵醪在4 ℃于8 500 r/min離心20 min，收集菌體。分別在含菌體的離心管中加入30 mL 0.85 g/L NaCl溶液，混勻，然后在4 ℃于8 500 r/min離心15 min，收集菌體，每克濕菌體中加入10 mL pH 4.2、0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液，均質(zhì)分散均勻，制成100 mg/mL菌懸液。

1.3.4 溶液的配制

0.3 mol/L MSG底物溶液的配制：稱取MSG 56.31 g溶于40 ℃乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 4.2，0.2 mol/L或0.4 mol/L）900 mL，調(diào)節(jié)pH 4.2，定容至1 L。MSG終濃度為0.3 mol/L。

0.2 mol/L MSG-0.2 mol/L GABA混合溶液配制：稱取MSG 3.746 0 g和GABA 2.062 0 g溶于90 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 4.2，0.2 mol/L），調(diào)節(jié)pH 4.2，定容至100 mL。MSG及GABA終濃度均為0.2 mol/L。

1.3.5 GABA和L-Glu含量的測定

1.3.5.1 流動(dòng)相

參照文獻(xiàn)[17]進(jìn)行配制。流動(dòng)相A：稱取8.205 g乙酸鈉，溶于900 mL超純水，加入三乙胺0.5 mL、乙酸0.7 mL和乙腈5.0 mL，調(diào)節(jié)至pH 5.8，定容至1 000 mL。流動(dòng)相B：乙腈-水（60∶40，V/V）。

1.3.5.2 衍生化方法

衍生化方法參照文獻(xiàn)[18]，略作改進(jìn)。取100 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液或轉(zhuǎn)化反應(yīng)終止液注入1.5 mL的錐形離心管，加入50 μL乙腈-水-三乙胺-PITC（7∶1∶1∶1，V/V），混勻，室溫放置1 h后，加入150 μL流動(dòng)相A-流動(dòng)相B（80∶20，V/V）混合液，渦旋混合儀振蕩1 min，然后加入600 μL正己烷，渦旋混合儀振蕩1 min，靜置10 min。用注射器吸取下層溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾備測。

1.3.5.3 色譜條件

參照文獻(xiàn)[17]，略有改變。色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長254 nm；進(jìn)樣量20 μL；柱溫25 ℃。采用流動(dòng)相A-流動(dòng)相B（80∶20，V/V）以0.6 mL/min進(jìn)行洗脫。

1.3.6 732陽離子交換樹脂交換物的洗脫

采用0.15 mol/L Na2CO3溶液進(jìn)行洗脫。將樹脂與0.15 mol/L Na2CO3按1∶10（g/mL）混合，室溫振蕩洗脫5 min，濾布過濾，取洗脫液，樹脂重復(fù)洗脫2 次，合并洗脫液。將洗脫液于4 ℃、8 500 r/min離心5 min，取上清液備測。

1.3.7 pH值對細(xì)胞GAD活性影響的測定

分別取pH值為3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2的0.3 mol/L MSG溶液（以0.4 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液配制）1 mL，加入菌懸液1 mL，40 ℃水浴反應(yīng)6 h，加入無水乙醇8 mL，混勻，8 500 r/min離心15 min，取上清液備測。以pH值分別為3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2不含MSG的0.4 mol/L乙酸-乙酸鹽緩沖液1 mL替代MSG溶液按同樣操作作為對照。細(xì)胞GAD活力單位定義為：在上述測定條件下1 h生成1 μmol GABA所需要的酶量為1個(gè)酶活單位（U）。GAD活性以每毫升反應(yīng)液的酶活力單位表示，即U/mL。

1.3.8 732陽離子交換樹脂對L-Glu和GABA交換能力的測定

稱取樹脂2 g，加入4 mL 0.2 mol/L MSG-0.2 mol/L GABA混合溶液，混勻并靜置5 min，濾布過濾，然后將樹脂放入4 mL 0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 4.2），靜置5 min，洗滌未交換或吸附不牢的L-Glu或GABA，重復(fù)洗滌2 次，再對交換或吸附在樹脂上的物質(zhì)進(jìn)行洗脫，分別測定洗脫液GABA和L-Glu的含量。

1.3.9 不同離子型的732陽離子交換樹脂對反應(yīng)緩沖體系pH值影響的測定

分別稱取H型和Na型732樹脂25 g，加入0.2 mol/L、pH 4.2乙酸-乙酸鈉緩沖液50 mL，混勻，立即測定溶液的pH值，然后再置于40 ℃、80 r/min水浴振蕩器1 h，冷卻，測定溶液的pH值。以不加樹脂的0.2 mol/L、pH 4.2乙酸-乙酸鈉緩沖液50 mL按同樣處理作為對照。

1.3.10 732陽離子交換樹脂pH值的平衡

稱取經(jīng)水洗至中性并用紗布濾干水分的732陽離子交換樹脂20 g，加入0.2 mol/L、pH 4.2的乙酸-乙酸鈉緩沖液40 mL，室溫浸泡30 min（間歇攪拌），紗布過濾，再在樹脂中加入0.2 mol/L、pH 4.2的乙酸-乙酸鈉緩沖液40 mL，室溫浸泡30 min（間歇攪拌），紗布過濾。重復(fù)按此操作直至前后2 次的濾液pH值一致，表明已平衡至終點(diǎn)。

732陽離子交換樹脂的L-Glu平衡則在0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 4.2）平衡的基礎(chǔ)上，再用含0.2 mol/L L-Glu的乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 4.2，0.2 mol/L）平衡2 次。

1.3.11 732陽離子交換樹脂對GAD活性影響的測定

稱取已用乙酸-乙酸鈉緩沖液或含L-Glu的乙酸-乙酸鈉緩沖液平衡的樹脂10 g，加入0.3 mol/L MSG溶液10 mL、菌懸液10 mL，混勻，然后于80 r/min、40 ℃水浴振蕩器反應(yīng)24 h，紗布過濾，分別收集濾液（記為轉(zhuǎn)化液）和樹脂，再對樹脂進(jìn)行洗脫（記為洗脫液）。分別將轉(zhuǎn)化液和洗脫液于4 ℃、8 500 r/min離心15 min，取上清液用于測定pH值和GABA含量。以不加樹脂按同樣操作作為對照組。

1.3.12 反應(yīng)時(shí)間對732陽離子交換樹脂對GAD活性影響的測定

稱取已用含L-Glu的乙酸-乙酸鈉緩沖液平衡的樹脂10 g，加入0.3 mol/L MSG溶液10 mL、菌懸液10 mL，混勻，然后于80 r/min、40 ℃水浴振蕩器分別反應(yīng)3、6、9、12 h和24 h，紗布過濾，分別收集濾液（記為轉(zhuǎn)化液）和樹脂，再對樹脂進(jìn)行洗脫（記為洗脫液）。分別將轉(zhuǎn)化液和洗脫液于4 ℃、8 500 r/min離心15 min，取上清液用于測定pH值和GABA含量。以不加樹脂按同樣操作作為對照組。

1.3.13 732陽離子交換樹脂添加量對GAD活性影響的測定

分別稱取已用含L-Glu的乙酸-乙酸鈉緩沖液平衡的樹脂5、7.5、10、12.5、15 g，分別加入0.3 mol/L MSG溶液10 mL、菌懸液10 mL，混勻，然后于80 r/min、40 ℃水浴振蕩器反應(yīng)24 h，紗布過濾，分別收集濾液（記為轉(zhuǎn)化液）和樹脂，再對樹脂進(jìn)行洗脫（記為洗脫液）。分別將轉(zhuǎn)化液和洗脫液于4 ℃、8 500 r/min離心15 min，取上清液用于測定pH值和GABA含量。以不加樹脂按同樣操作作為對照組。

1.3.14 L-Glu/MSG（2∶1）固體混合物添加量對GAD活性影響的測定

稱取已用含L-Glu的乙酸-乙酸鈉緩沖液平衡的樹脂10 g，加入0.3 mol/L MSG溶液10 mL、菌懸液10 mL，再按反應(yīng)體系液體積分別加入15、30、45 g/L和60 g/L的L-Glu/MSG（質(zhì)量比2∶1）固體混合物，混勻，然后于80 r/min、40 ℃水浴振蕩器反應(yīng)24 h，紗布過濾，分別收集濾液（記為轉(zhuǎn)化液）和樹脂，再對樹脂進(jìn)行洗脫（記為洗脫液）。分別將轉(zhuǎn)化液和洗脫液于4 ℃、8 500 r/min離心15 min，取上清液用于測定pH值和GABA含量。以不加樹脂按同樣操作作為對照組。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用IBM SPSS Statistics 19.0軟件以獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對細(xì)胞GAD轉(zhuǎn)化活性的影響

圖1 pH值對屎腸球菌LNSF2細(xì)胞GAD活性的影響Fig.1 Effect of pH on the GAD activity of E. faecium LNSF2 cells

由圖1可見，細(xì)胞GAD的最適反應(yīng)pH值為4.4，當(dāng)反應(yīng)體系的pH值大于4.4時(shí)，細(xì)胞GAD活性迅速下降。由于GAD催化L-Glu脫羧生成GABA，反應(yīng)體系pH值會(huì)升高，如采用最適轉(zhuǎn)化反應(yīng)pH值作為催化反應(yīng)體系pH值，將會(huì)增加pH值的控制難度，因此選擇pH 4.2作為細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系的pH值。

2.2 732陽離子交換樹脂對轉(zhuǎn)化反應(yīng)緩沖體系pH值的影響

表1 不同離子型732陽離子交換樹脂對反應(yīng)緩沖體系pH值及其對物質(zhì)交換能力的影響Table1 Effect of different ion types of 732 cation-exchange resins on pH of the reaction buffer system and their exchange capacity

由表1可知，加入H型或Na型732陽離子交換樹脂后，乙酸-乙酸鈉緩沖液的pH值均發(fā)生改變，H型樹脂會(huì)造成緩沖液的pH值下降，Na型樹脂則會(huì)造成緩沖液的pH值升高。反應(yīng)體系的pH值是細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)的重要條件，pH值降低或升高均會(huì)導(dǎo)致GAD活性大幅下降（圖1）。

同時(shí)，緩沖液體系pH值的改變，也將影響樹脂對轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系L-Glu（底物）和GABA（產(chǎn)物）的交換能力。由表1可知，在含L-Glu和GABA的pH 4.2、0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液中，H型樹脂對L-Glu交換能力大于GABA，而Na型樹脂對GABA交換能力大于L-Glu。結(jié)果表明，不同離子型732陽離子交換樹脂會(huì)因?yàn)殡x子的游離或與環(huán)境介質(zhì)的離子交換而改變反應(yīng)體系pH值，導(dǎo)致物質(zhì)的電離狀態(tài)發(fā)生改變，從而改變樹脂與物質(zhì)的交換能力。

因此，732陽離子交換樹脂應(yīng)用于酶催化反應(yīng)體系，必須先平衡至反應(yīng)體系的pH值，防止樹脂改變反應(yīng)體系的初始pH值。

2.3 732陽離子交換樹脂對GAD活性的影響

表2 732陽離子交換樹脂對屎腸球菌LNSF2細(xì)胞GAD活性的影響Table2 Effect of 732 cation-exchange resins on the GAD activity of E. faecium LNSF2 cells

由表2可知，經(jīng)含L-Glu的pH 4.2、0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液平衡的732陽離子交換樹脂可顯著提高屎腸球菌細(xì)胞GAD轉(zhuǎn)化活性，轉(zhuǎn)化反應(yīng)24 h，GABA產(chǎn)量較對照組提高了25.31%（P＜0.05）。然而，僅采用pH 4.2、0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液平衡的732陽離子交換樹脂對屎腸球菌細(xì)胞GAD轉(zhuǎn)化活性卻未表現(xiàn)促進(jìn)作用，GABA產(chǎn)量反而降低了3.32%，但與對照組無顯著差異（P＞0.05）。由于732陽離子交換樹脂對GAD轉(zhuǎn)化反應(yīng)底物（L-Glu）有一定交換能力，因其交換了部分L-Glu，從而導(dǎo)致反應(yīng)體系游離的底物濃度下降，進(jìn)而影響GAD的催化反應(yīng)速率，這可能是未經(jīng)L-Glu平衡的樹脂產(chǎn)量略低于對照組的原因。

上述分析表明，經(jīng)L-Glu平衡的732陽離子交換樹脂可顯著提高細(xì)胞GAD活性，增加GABA產(chǎn)量，因此選擇含L-Glu的pH 4.2、0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液平衡的732陽離子交換樹脂與屎腸球菌細(xì)胞構(gòu)建復(fù)合轉(zhuǎn)化體系。

2.4 反應(yīng)時(shí)間對732陽離子交換樹脂-細(xì)胞GAD復(fù)合轉(zhuǎn)化體系的影響

圖2 反應(yīng)時(shí)間對732陽離子交換樹脂對屎腸球菌LNSF2細(xì)胞GAD轉(zhuǎn)化活性的影響Fig.2 Effect of reaction time on the GAD activity of E. faecium LNSF2 cells in the presence of 732 cation-exchange resins

由圖2可知，在轉(zhuǎn)化反應(yīng)3 h內(nèi)，加732陽離子交換樹脂實(shí)驗(yàn)組的GABA產(chǎn)量與對照組相差不大，分別為（0.65±0.01）mmol和（0.64±0.06）mmol。隨著反應(yīng)時(shí)間延長，實(shí)驗(yàn)組的GABA產(chǎn)量逐漸高于對照組，轉(zhuǎn)化反應(yīng)24 h，實(shí)驗(yàn)組的GABA產(chǎn)量為（3.03±0.09）mmol，較對照組GABA產(chǎn)量（2.37±0.18）mmol提高了27.64%。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化反應(yīng)24 h的GABA產(chǎn)量和增產(chǎn)率均最大，因此選擇轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間為24 h。

2.5 732陽離子交換樹脂不同添加量對細(xì)胞GAD轉(zhuǎn)化活性的影響

圖3 732陽離子交換樹脂不同添加量對屎腸球菌LNSF2細(xì)胞GAD轉(zhuǎn)化活性的影響Fig.3 Effect of the amount of 732 cation-exchange resins on the GAD activity of E. faecium LNSF2 cells

圖3顯示，隨著732陽離子交換樹脂添加量增加，GABA的產(chǎn)量也增加，當(dāng)實(shí)驗(yàn)體系732陽離子交換樹脂的添加量達(dá)到10 g時(shí)，GABA產(chǎn)量達(dá)到了（2.99±0.08）mmol，較不添加732陽離子交換樹脂的對照組GABA產(chǎn)量（2.26±0.07）mmol增加了32.30%，繼續(xù)增加732陽離子交換樹脂添加量，GABA的產(chǎn)量和增產(chǎn)率趨于平緩。因此，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的20 mL轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中，732陽離子交換樹脂的添加量為10 g較為適宜。

2.6 不同固體底物添加量對732陽離子交換樹脂-GAD催化體系活性的影響

由于L-Glu在水中的溶解度較小，僅為0.86%（25 ℃）[19]，在pH 4.2的酸性環(huán)境中其溶解度更小，本研究采用MSG配制的0.3 mol/L L-Glu底物溶液已經(jīng)接近L-Glu在0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 4.2）中的飽和濃度。L-Glu是弱酸，與其一鈉鹽可以組成弱緩沖體系，楊勝遠(yuǎn)等[10]研究表明，當(dāng)L-Glu與MSG以2∶1混合時(shí)，其溶液pH值為4.2，當(dāng)L-Glu和MSG添加量超過其溶解度時(shí)，將以固體形式存在，當(dāng)溶液中的L-Glu作為GAD催化反應(yīng)底物消耗時(shí)，固態(tài)L-Glu可溶解到反應(yīng)體系的溶液中，在一定程度上可維持反應(yīng)體系的底物濃度和pH值。

對L-Glu/MSG（2∶1）固體混合物不同添加量對732陽離子交換樹脂-細(xì)胞GAD反應(yīng)體系轉(zhuǎn)化活性的影響進(jìn)行考察，結(jié)果（圖4）顯示，當(dāng)L-Glu/MSG固體混合物的添加量小于30 g/L時(shí)，隨著添加量增加，732陽離子交換樹脂的實(shí)驗(yàn)組和無732陽離子交換樹脂對照組的GABA產(chǎn)量均顯著上升。當(dāng)L-Glu/MSG固體混合物添加量為30 g/L時(shí)，實(shí)驗(yàn)組GABA產(chǎn)量從（3.25±0.12）mmol提高到（4.57±0.11）mmol，提高了40.62%；對照組GABA產(chǎn)量從（2.29±0.08）mmol提高到（3.49±0.16）mmol，提高了52.40%；相對于既不添加732陽離子交換樹脂也不添加L-Glu/MSG（2∶1）固體混合物的轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)果（（2.29±0.08）mmol），添加732陽離子交換樹脂及L-Glu/MSG（2∶1）固體混合物30 g/L的實(shí)驗(yàn)組GABA產(chǎn)量（（4.57±0.11）mmol）提高了99.56%。

由圖4可知，隨著L-Glu/MSG固體混合物添加量增加，轉(zhuǎn)化液的終pH值呈下降趨勢，說明添加L-Glu/MSG固體混合物有助于維持催化體系的pH值，更有利于細(xì)胞GAD轉(zhuǎn)化反應(yīng)。當(dāng)L-Glu/MSG固體混合物添加量超過30 g/L，實(shí)驗(yàn)組GABA產(chǎn)量卻有所下降，原因尚不明。

隨著L-Glu/MSG固體混合物的添加量增加，實(shí)驗(yàn)組相對于對照組的GABA增產(chǎn)率呈下降趨勢，在0～45 g/L范圍內(nèi)，GABA增產(chǎn)率由41.92%降到了15.35%。說明L-Glu/MSG固體混合物對反應(yīng)體系pH值的維持作用弱化了732陽離子交換樹脂因穩(wěn)定反應(yīng)體系pH值所產(chǎn)生的促進(jìn)細(xì)胞GAD轉(zhuǎn)化活性的優(yōu)勢。然而，實(shí)驗(yàn)組相對于對照組GABA產(chǎn)量仍可提高15%以上，說明732陽離子交換樹脂除了維持反應(yīng)體系pH值的作用外，可能還存在其他促進(jìn)細(xì)胞GAD轉(zhuǎn)化活性的機(jī)制。

綜上分析表明，在轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中添加30 g/L L-Glu/MSG（2∶1）固體混合物，可穩(wěn)定轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系的pH值，提高細(xì)胞GAD轉(zhuǎn)化活性，顯著增加GABA的產(chǎn)量。因此在732陽離子交換樹脂-GAD催化體系中，選擇添加30 g/L的L-Glu/MSG固體混合物作為控制反應(yīng)體系pH值的備用酸和備用反應(yīng)底物。

圖4 不同L-Glu/MSG（2∶1）固體混合物添加量對732陽離子交換樹脂-細(xì)胞GAD轉(zhuǎn)化體系活性的影響Fig.4 Effect of the amount of L-Glu/MSG (2∶1) solid mixture on biotransformation activity of the complex system

3 討 論

乳酸菌通過GAD催化L-Glu的α-羧基發(fā)生脫羧作用生成GABA，提高細(xì)胞微環(huán)境的pH值，抵抗酸性環(huán)境對其生長繁殖的不利影響，這是乳酸菌的耐酸機(jī)制之一[20-24]?；谠诩?xì)菌中的作用，極大多數(shù)細(xì)菌的GAD在酸性條件下具有較高活性，在中性和堿性環(huán)境活性極其微弱或完全喪失[22,24-25]。圖1表明，當(dāng)pH值升高，GAD活性快速下降，適宜的反應(yīng)pH值范圍很窄。GAD對pH值的依賴性對屎腸球菌維持正常生理功能，抵抗代謝過程中的pH值急劇變化具有重要意義，然而卻對屎腸球菌GAD的開發(fā)利用十分不利，在GABA生產(chǎn)過程中很難做到對pH值的精準(zhǔn)控制。在生產(chǎn)過程中，為了提高設(shè)備利用率和減少成本，通常采用較高的酶蛋白或菌體進(jìn)行生產(chǎn)，總GAD活性高，反應(yīng)較激烈，pH值變化較大，采用緩沖液難于控制反應(yīng)體系的pH值。同時(shí)高濃度的緩沖液對GAD活性或下游GABA的提取純化均不利。采用無機(jī)酸（如鹽酸、硫酸）調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值是目前常用的手段，但這種方法也容易產(chǎn)生大量的鹽而造成GABA下游提取純化困難。由于非均質(zhì)固體酸容易分離和回收，是一種有效的、環(huán)境友好的控制pH值的手段，在乙?；⑼榛?、?；?、水解和脫水等化學(xué)反應(yīng)中均有所應(yīng)用[26-27]。為了減少鹽的形成和酸的用量，Dinh等[28]在以大腸桿菌工程菌BL21（DE3）制備的純GAD催化反應(yīng)中采用強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂Amberlyst 15作為固體酸，利用離子交換的H+控制反應(yīng)體系的pH值，結(jié)果轉(zhuǎn)化率提高了13%～67%。理論上，732陽離子交換樹脂可通過與反應(yīng)體系的Na+、GABA或L-Glu解離的陽離子發(fā)生離子交換而釋放H+，從而達(dá)到了控制反應(yīng)體系pH值和減少反應(yīng)體系鹽的作用。然而，表1表明732陽離子交換樹脂的加入會(huì)很快與體系的陽離子發(fā)生交換而改變反應(yīng)體系的pH值，偏離屎腸球菌GAD的適宜反應(yīng)pH值，說明反應(yīng)體系存在的多種陽離子均可與732陽離子交換樹脂發(fā)生交換，無法實(shí)現(xiàn)GABA與樹脂H+對等交換而適時(shí)調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液pH值。雖然通過先以含L-Glu的pH 4.2、0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液平衡732樹脂，再添加到反應(yīng)體系，體系初始反應(yīng)pH值可以穩(wěn)定在設(shè)計(jì)的適宜反應(yīng)pH值（表2），但經(jīng)過平衡后，樹脂攜帶的H+減少，對反應(yīng)體系pH值的穩(wěn)定作用也會(huì)減弱（圖2）。表2結(jié)果表明在屎腸球菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系中添加未經(jīng)L-Glu平衡的732陽離子交換樹脂，轉(zhuǎn)化活性較不添加樹脂的對照組略有下降，說明732陽離子交換樹脂在非GAD純酶的細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系中并不能起到促進(jìn)GAD活性作用，與Dinh等[28]在純GAD反應(yīng)系統(tǒng)中獲得的結(jié)果并不一致。綜上分析可見，在共反應(yīng)體系中通過陽離子交換釋放H+達(dá)到控制反應(yīng)體系的pH值，從而促進(jìn)GAD的轉(zhuǎn)化活性，并不是陽離子交換樹脂促進(jìn)GAD活性的唯一機(jī)制。

圖2和圖4均表明反應(yīng)液中仍有相當(dāng)多L-Glu未轉(zhuǎn)化，說明對照組較添加經(jīng)L-Glu平衡的732陽離子交換樹脂實(shí)驗(yàn)組的產(chǎn)量低，其原因并非是L-Glu底物不足所造成。

細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程中，由于細(xì)胞存在屏障，形成相對獨(dú)立的微環(huán)境，對L-Glu與GABA存在傳質(zhì)阻力，不利于全細(xì)胞的催化過程。趙偉睿等[29]通過以二甲苯對表達(dá)重組GAD的工程菌BL21(DE3)-pET28a-gadB進(jìn)行透性化處理，結(jié)果菌體表觀催化活性提高了12.4 倍。L-Glu底物與GABA在細(xì)胞內(nèi)外的濃度差也是傳質(zhì)速度的重要因素，經(jīng)L-Glu平衡的732陽離子交換樹脂所交換的L-Glu與轉(zhuǎn)化生成的GABA發(fā)生交換，可維持轉(zhuǎn)化液游離L-Glu濃度，減少轉(zhuǎn)化液游離GABA濃度，加快L-Glu和GABA進(jìn)出細(xì)胞的速度，從而提高GAD的催化效率，可能是732陽離子交換樹脂促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化GAD活性的機(jī)制之一。同時(shí)，如果屎腸球菌GAD存在產(chǎn)物抑制效應(yīng)，GABA經(jīng)732陽離子交換樹脂交換后，轉(zhuǎn)化液中游離GABA濃度降低，將可緩解產(chǎn)物抑制作用。

斯晗[30]研究表明谷氨酸棒桿菌催化GABA分解代謝的γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶（GABA-T）和γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶-琥珀酸半醛脫氫酶偶聯(lián)酶（GABA-T-SSADH）在pH 5.0以上時(shí)已具有催化活性，當(dāng)pH值大于6.0時(shí)，酶活性快速升高。圖2～4顯示，反應(yīng)體系的終pH值均已達(dá)到5.2以上，因此隨著轉(zhuǎn)化液游離GABA增加，可能會(huì)造成GABA-T或GABA-T-SSADH對GABA的代謝作用增強(qiáng)。GABA經(jīng)732陽離子交換樹脂交換后，轉(zhuǎn)化液中游離GABA濃度下降，可減少GABA被代謝。

綜上可知，732陽離子交換樹脂促進(jìn)細(xì)胞GAD轉(zhuǎn)化活性的機(jī)制可能有多種途徑，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，732陽離子交換樹脂可顯著促進(jìn)屎腸球菌細(xì)胞GAD轉(zhuǎn)化活性，提高GABA的產(chǎn)量，今后通過對732陽離子交換樹脂-GAD復(fù)合體系的轉(zhuǎn)化工藝進(jìn)行改進(jìn)，有望進(jìn)一步提高GABA的產(chǎn)率，拓寬732陽離子交換樹脂在生物合成領(lǐng)域的應(yīng)用。研究結(jié)果在理論上對其他生物合成研究與開發(fā)也具有很好的參考意義。