（司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200063）

藥物輔助犯罪（drug-facilitated crime，DFC）是指在中樞神經(jīng)抑制劑、興奮劑和致幻劑等精神活性物質(zhì)影響下，實(shí)施的麻醉搶劫、性犯罪等不法行為[1]。其中藥物輔助性犯罪（drug-facilitated sexual assault，DFSA）[2-3]案件，俗稱迷奸案，是法醫(yī)毒物鑒定中的一個(gè)特定案件類型[4]。典型的場(chǎng)景如酒吧中趁女孩不注意，將精神活性物質(zhì)投入飲料中，利用其致人快速昏睡、幻覺、短暫記憶喪失等作用實(shí)施性犯罪。我國的藥物輔助犯罪案件中，20世紀(jì)主要以麻醉搶劫為主[5]，進(jìn)入21世紀(jì)，隨著網(wǎng)絡(luò)信息傳播、網(wǎng)購易獲得性的泛濫，DFSA案件急劇增長。

新型苯二氮菒卓類化合物是近兩年猛增、在全球范圍內(nèi)泛濫的策劃藥[6-7]，是在常見臨床藥物地西泮、三唑侖等原有化學(xué)結(jié)構(gòu)上進(jìn)行修飾、引入基團(tuán)而設(shè)計(jì)、制造。這些新型苯二氮菒卓類化合物并非臨床使用，但被不法分子在網(wǎng)上公開販賣，標(biāo)以“彌漫之夜”“夜戀”“第四態(tài)未知元素”等名稱，甚至還公然標(biāo)注“無法檢測(cè)、放心使用”，給社會(huì)安全、穩(wěn)定帶來極大的隱患。這些新型策劃藥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)時(shí)缺少對(duì)照品和有效的檢驗(yàn)確認(rèn)方法，并且藥代動(dòng)力學(xué)與藥理學(xué)研究和數(shù)據(jù)缺乏，給法醫(yī)毒物鑒定帶來極大挑戰(zhàn)。

本研究從標(biāo)有“彌漫之夜”的乳白色液體中確認(rèn)新型苯二氮菒卓類策劃藥2-氯地西泮［又名diclazepam，2-chlorodiazepam，Ro5-3448；化學(xué)名 7-氯-5-（2-氯苯基）-1-甲基-1，3-二氫-2H-1，4-苯并二氮 雜 菒卓 -2- 酮 ，7-chloro-5-（2-chlorophenyl） -1-methyl-1，3-dihydro-2H-1，4-benzodiazepin-2-one；CAS號(hào)2894-68-0；化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1A］。由于2-氯地西泮存在同分異構(gòu)體4-氯地西泮［又名4-chlorodiazepam，Ro5-4864；化學(xué)名 7-氯-5-（4-氯苯基）-1-甲基-1，3-二氫-2H-1，4-苯并 二 氮 雜菒卓-2-酮 ，7-chloro-5-（4-chlorophenyl）-1-methyl-1，3-dihydro-2H-1，4-benzodiazepin-2-one；CAS 號(hào) 14439-61-3；化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1B］，因此本研究亦對(duì)其進(jìn)行區(qū)別。本研究將對(duì)2-氯地西泮進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)，并開展法醫(yī)毒物學(xué)討論，希望為國內(nèi)同行針對(duì)此類案件的解決提供參考。

圖1 2-氯地西泮（A）和4-氯地西泮（B）的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

UltiMate 3000 UHPLC液相系統(tǒng)和Thermo ScientificTMQ ExactiveTM組合型四極桿Orbitrap質(zhì)譜儀質(zhì)譜（LC-QE）、XcaliburTM3.0 軟件（美國 Thermo Fisher Scientific公司）。

7890A GC-5975C MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GCMS）儀、MSD ChemStation 工作站（美國 Agilent公司）。

AV-500超導(dǎo)核磁共振儀（1H-NMR，美國Bruker公司）。

2-氯地西泮（1 mg/mL，甲醇）購自美國Cerilliant公司；4-氯地西泮購自江蘇艾康生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司；甲醇（HPLC級(jí)）購自美國Sigma-Aldrich公司；甲酸和乙酸胺（色譜純）來源于瑞士Fluka公司；超純水為實(shí)驗(yàn)室Milli-Q超純水系統(tǒng)自制；其他化學(xué)試劑及藥品均為分析純。

1.2 儀器條件

1.2.1 液相高分辨質(zhì)譜條件

色譜條件：液相柱為Restek Allure PFP丙基柱（100 mm×2.1 mm，5 μm），前接 Phenomenex保護(hù)柱（12.5 mm×2.1 mm，5 μm）。 流動(dòng)相為 V乙腈∶V緩沖液=70∶30，緩沖液為20 mmol/L乙酸胺-0.1%甲酸溶液。恒流 200μL/min。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離-正離子模式（ESI+）。離子源電壓3.5kV。殼氣、輔助加熱氣和碰撞氣均使用高純氮。輔助加熱溫度300℃，毛細(xì)管溫度350℃。質(zhì)譜檢測(cè)使用全掃描-信號(hào)觸發(fā)二級(jí)質(zhì)譜（full MS-ddMS2）模式，母離子全掃描的分辨率設(shè)為35 000（半峰寬），子離子的掃描分辨率為17500。全掃描范圍質(zhì)荷比（m/z）為 60～800，碰撞能量為 60、70、80eV。 在每批次進(jìn)樣分析前，用美國Thermo Fisher Scientific公司提供的校正液對(duì)質(zhì)譜的質(zhì)量軸進(jìn)行校正，以使質(zhì)量數(shù)偏差小于 5×10-6。

1.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀條件

色譜條件：DB-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；載氣為氦氣，流速 1 mL/min；初溫 100℃保持1.5min，以25℃/min程序升溫至280℃保持15min。

質(zhì)譜條件：進(jìn)樣口溫度為250℃，離子源溫度230℃，采用全掃描模式，質(zhì)量范圍m/z 50～500。

1.2.3 超導(dǎo)核磁共振儀條件

以CDCl3為溶劑，探頭溫度300.0K，所有實(shí)驗(yàn)均采用標(biāo)準(zhǔn)脈沖序列。

1.3 樣品收集

警方提供的標(biāo)有“彌漫之夜”的塑料瓶，內(nèi)有約4mL乳白色液體。乳白色液體經(jīng)檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)常見的毒（藥）物成分。

1.4 樣品前處理

取乳白色液體0.1 mL，置于10 mL離心管中，加入乙酸乙酯2mL，渦旋混合1min，以離心半徑12cm，3000r/min，離心3min，轉(zhuǎn)移有機(jī)層。檢材中再加1滴10%NaOH 溶液，使檢材呈堿性（pH=11～12），加入乙酸乙酯2 mL，渦旋混合1 min，以離心半徑12 cm，3 000 r/min，離心3 min，合并乙酸乙酯提取液，于約60℃水浴中空氣流下吹干，殘留物加50μL甲醇復(fù)溶，取1μL進(jìn)GC-MS。殘留物中再加入200μL甲醇稀釋，取5μL進(jìn)LC-QE。

取乳白色液體2 mL，置于10 mL離心管中，加入二氯甲烷3 mL，渦旋混合2 min，以離心半徑12 cm，3 000 r/min，離心 3 min，轉(zhuǎn)移有機(jī)層，于約 60℃水浴中氮?dú)饬飨麓蹈桑?H-NMR分析。

2 結(jié) 果

乳白色液體提取后首先經(jīng)LC-QE分析，在2.7min處出現(xiàn)明顯色譜峰（圖2），特征質(zhì)譜離子m/z分別為319.0390、321.0359、323.0323，應(yīng)為同位素離子峰簇，峰簇的離子豐度比約為9∶6∶1，推測(cè)含有兩個(gè)氯原子。限定結(jié)構(gòu)式含兩個(gè)氯原子、質(zhì)量誤差＜5×10-6，以精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行Xcalibur檢索，準(zhǔn)分子離子峰元素組成可能為C14H11Cl2N5或C16H13Cl2N2O。

經(jīng)1H-NMR 分析（圖 3），可見 10 組峰：3.81，3.84（d，1 H）；4.89，4.92（d，1 H）；7.03，7.04（d，1 H）；7.50，7.51，7.52，7.53（dd，1H）；7.29，7.31（d，1H）；7.37～7.39（m，1 H）；7.40～7.42（m，1 H）；7.37～7.47（m，1 H）；7.43～7.47（m，1 H）；3.43（s，3 H）。 質(zhì)子總個(gè)數(shù)為 12，排除C14H10Cl2N5，元素組成應(yīng)為C16H12Cl2N2O，精確質(zhì)量數(shù)為318.0321，平均相對(duì)分子量為319.185。

圖2 可疑色譜峰的LC-QE質(zhì)譜圖

圖3 檢材的1H-NMR結(jié)果

采用GC-MS分析，在11.16min有一特征碎片離子 m/z為 318、290、283、255的色譜峰。經(jīng)美國國家科學(xué)技術(shù)研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）庫檢索，匹配度最高的化合物為7-chloro-5-（4-chlorophenyl）-1-methyl-1，3-dihydro-2H-1，4-benzodiazepin-2-one（即 4-氯地西泮），但匹配度只有66%。此外，該化合物與地西泮具有相同的特征碎片離子m/z為283、255，而分子離子峰m/z為318與283的質(zhì)量數(shù)相差35（一個(gè)氯原子），進(jìn)一步說明可能為一個(gè)氯原子取代的地西泮。由此推斷該可疑化合物為4-氯地西泮的同分異構(gòu)體，僅是氯的取代位置不一樣。

為確認(rèn)其結(jié)構(gòu)，采用GC-MS分析2-氯地西泮和4-氯地西泮對(duì)照品。兩種化合物雖然有相同的碎片離子（圖 4～5），但保留時(shí)間不同，分別為 11.16 和 11.92min。該案中可疑化合物與2-氯地西泮具有相同的特征碎片離子，兩者的保留時(shí)間誤差＜1%，并且其1H-NMR結(jié)果與文獻(xiàn)[8]中2-氯地西泮相一致（表1）。因此，最終確認(rèn)，該案乳白色液體中檢出2-氯地西泮成分。

圖4 2-氯地西泮的GC-MS質(zhì)譜圖

圖5 4-氯地西泮的GC-MS質(zhì)譜圖

表1 與文獻(xiàn)[8]的1H-NMR結(jié)果比較

3 討 論

2-氯地西泮目前尚不在GC-MS的NIST庫中，如何分析、確認(rèn)這些不包含在常規(guī)方法、標(biāo)準(zhǔn)譜庫中的未知化合物是法醫(yī)毒物化學(xué)的難點(diǎn)。高分辨質(zhì)譜是未知化合物鑒定的首選[9]，具有高質(zhì)量分辨率功能。本研究利用LC-QE，得到可疑化合物的精確分子量，再經(jīng)同位素離子豐度比的解析，推測(cè)出元素組成。進(jìn)一步經(jīng)1H-NMR分析，基本鎖定元素組成為C16H12Cl2N2O的目標(biāo)物。如果能增加碳譜，則2-氯地西泮和4-氯地西泮結(jié)構(gòu)區(qū)別更明確。但由于本研究購置標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品進(jìn)行GC-MS和LC-QE分析，使兩化合物通過色譜分離、區(qū)分、確認(rèn)，因此不再進(jìn)行碳譜分析。

2-氯地西泮和4-氯地西泮均屬于新型苯二氮菒卓類化合物[10]。2013年，歐洲毒品和毒癮監(jiān)測(cè)中心（European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction，EMCDDA）報(bào)道發(fā)現(xiàn) 2-氯地西泮，2016 年發(fā)現(xiàn)4-氯地西泮。2-氯地西泮最早合成于20世紀(jì)60年代，但未用于臨床治療，近些年出現(xiàn)在地下市場(chǎng)[8]。2-氯地西泮結(jié)構(gòu)與地西泮相近，根據(jù)已有藥理作用研究，與地西泮相比：2-氯地西泮對(duì)小鼠的肌肉松弛、鎮(zhèn)靜作用強(qiáng)1～2倍[8]；降低大鼠的運(yùn)動(dòng)活性和沖突活性的作用強(qiáng)4～8倍[11]；與γ-氨基丁酸A型受體結(jié)合的親和力強(qiáng)30倍[12]。2-氯地西泮進(jìn)入體內(nèi)后主要為去甲基化、羥化代謝[8]，主要代謝物包括地洛西泮、氯甲西泮和勞拉西泮，均具有藥理活性（圖6）。2-氯地西泮的消除半衰期約42h，尿液中地洛西泮的檢出時(shí)限約6 d，氯甲西泮和勞拉西泮的檢出時(shí)限可分別達(dá)11d和19d[13-14]。4-氯地西泮雖然同為新型苯二氮菒卓類化合物，但與γ-氨基丁酸A型受體結(jié)合的親和力弱，不同于常見苯二氮菒卓類化合物，其安眠鎮(zhèn)靜、抗焦慮等藥理作用差，而是外周苯二氮菒卓受體的有效配位體，具有神經(jīng)保護(hù)作用，目前被用于老年癡呆癥等方面的治療研究[15]。

圖6 2-氯地西泮在體內(nèi)的主要代謝途徑

本研究針對(duì)DFSA案件中出現(xiàn)的完全未知化合物，采用LC-QE獲得未知化合物的精確質(zhì)量數(shù)，結(jié)合1H-NMR確定未知化合物的元素組成和分子結(jié)構(gòu)式，通過GC-MS對(duì)特征碎片離子進(jìn)行分析，最終將未知物結(jié)構(gòu)確認(rèn)為2-氯地西泮，為DFSA案件的偵查和定性提供直接證據(jù)。本項(xiàng)目研究者將在此研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步擴(kuò)大新型苯二氮菒卓類化合物篩選范圍，不斷積累陽性案例數(shù)據(jù)。