曹 潔，呂曉革，李 宇，靳茜茜，儲(chǔ)曉云，王英元 ，孫俊紅

（1.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；2.重慶市公安局刑警總隊(duì)，重慶 401147；3.山西省腫瘤醫(yī)院，山西 太原 030009）

深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）是臨床上常見(jiàn)的周圍血管病，多發(fā)生于下肢，如治療不及時(shí)可造成不同程度的慢性靜脈功能不全，影響生活質(zhì)量；嚴(yán)重者可能發(fā)生血栓脫落導(dǎo)致肺動(dòng)脈血栓栓塞（pulmonary embolism，PE），從而危及生命[1-2]。 DVT和PE統(tǒng)稱為靜脈血栓栓塞（venous thromboembolism，VTE），是僅次于心肌梗死和腦卒中的第三大心血管疾病[3]。據(jù)報(bào)道[4]，DVT合并肺栓塞患者有高達(dá)5%～23%的死亡率，僅有1/3的患者在早期表現(xiàn)臨床癥狀，故極易漏診。近年來(lái)隨著DVT發(fā)病率的增加，與此相關(guān)的醫(yī)學(xué)及法律爭(zhēng)端也越來(lái)越多[5-6]。因此，DVT的檢驗(yàn)和鑒定已成為法醫(yī)病理學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題[7-8]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)前期建立的大鼠下腔靜脈完全結(jié)扎模型[9-10]，采用600Hz高分辨核磁共振儀研究大鼠尿液中的代謝物變化規(guī)律，結(jié)合模式識(shí)別方法，從大鼠尿液的代謝物譜中篩選出與DVT關(guān)系密切的小分子差異代謝物，為DVT的臨床診斷、法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)和鑒定提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Sprague-Dawley（SD）成年雄性大鼠 30只，SPF 級(jí)（中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK-2012-0004），體質(zhì)量180～200g，飼養(yǎng)室溫（24±2）℃，適應(yīng) 1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 本研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分均符合相關(guān)法律法規(guī)并通過(guò)山西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 儀器與材料

Bruker AVANCEⅢ 600 MHz核磁共振檢測(cè)儀（德國(guó)布魯克公司）；SCIENTZ-1LS冷凍離心濃縮儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；重水（美國(guó)Sigma公司）；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（天津光復(fù)精細(xì)化工研究所）；三甲基硅烷丙酸鈉鹽［sodium 3-trimethylsilyl-（2，2，3，3-d4）-1-propionate，TSP，英國(guó) Cambridge Isotope Laboratories公司］。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立及樣本收集

根據(jù)參考文獻(xiàn)[9-10]建立動(dòng)物模型，大鼠隨機(jī)分為模型組、對(duì)照組和假手術(shù)組，每組10只，術(shù)前12 h禁食禁水。

模型組：根據(jù)前期通過(guò)HE染色和Masson染色結(jié)果確定的血栓急性期模型進(jìn)行造模[9-10]。簡(jiǎn)述如下：10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，經(jīng)腹部正中切口進(jìn)腹，將小腸牽向術(shù)野左側(cè)，充分暴露下腔靜脈。在體視顯微鏡下，鈍性分離腹膜后腹主動(dòng)脈及下腔靜脈周圍結(jié)締組織，于左腎靜脈下方1 cm處將腹主動(dòng)脈和下腔靜脈剝離，用3/0縫合線結(jié)扎下腔靜脈，并將其分支逐個(gè)結(jié)扎。在下腔靜脈遠(yuǎn)端髂靜脈分叉處以無(wú)損血管夾夾閉下腔靜脈15min，以造成局部血管內(nèi)皮損傷。隨后去除血管夾，逐層關(guān)腹，皮下灑少許注射用青霉素鈉粉末預(yù)防感染。術(shù)后保暖單獨(dú)飼養(yǎng)。

假手術(shù)組除不結(jié)扎、不夾閉外，其余操作同模型組。

對(duì)照組不做任何處理。

模型組、假手術(shù)組大鼠在造模完成后48～72h（血栓形成急性期）放入代謝籠，自由飲水喂食，于冰上收集24h尿液；對(duì)照組大鼠同時(shí)取24h尿液。收集的尿液樣本于4℃ 15493×g離心20min，取上清液分裝至凍存管保存于-80℃冰箱中。

1.2.2 樣本前處理

樣本置于冰水混合物中解凍，搖勻，精密吸取500μL于1.5mL離心管中，加入200μL重水配置的磷酸緩沖液（0.2 mol/L Na2HPO4，0.2 mol/L NaH2PO4，0.01%TSP，pH=7.4），于 4℃下 15493×g 離心 20min，取600μL上清液于內(nèi)徑為5mm的核磁管中。

1.2.3 核磁共振氫譜檢測(cè)

采用預(yù)飽和水峰壓制（1D NOESY）脈沖序列對(duì)樣本進(jìn)行分析，參數(shù)設(shè)置：自旋弛豫延遲320ms，自由感應(yīng)衰減為64kb數(shù)據(jù)點(diǎn)，譜寬8000Hz，掃描64次。

1.2.4 譜圖處理

采用MestReNova 9.0（西班牙Mestrelab Research公司）進(jìn)行傅里葉變換得到尿液樣本的核磁共振氫譜（1H-nuclear magnetic resonance，1H-NMR）。 以 TSP（δ為0）的化學(xué)位移為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)譜圖進(jìn)行定標(biāo)校正，并進(jìn)行相位、基線調(diào)整。為消除殘余水峰的影響，去除δ為4.7～4.9區(qū)域水峰。δ為0.5～9.0區(qū)域以δ為0.004為單位進(jìn)行分段積分，所得積分值按每張圖譜的總積分面積進(jìn)行歸一化處理。根據(jù)Chenomx NMR Suite 8.2數(shù)據(jù)庫(kù)（加拿大Chenomx公司）和相關(guān)參考文獻(xiàn)[11-12]，對(duì)圖譜進(jìn)行指認(rèn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SIMCA-P 14.1軟件（瑞典Umetrics公司）進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析，分別為主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法-判別分析（partial least squares method-discriminant analysis，PLS-DA）和正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal PLS-DA，OPLS-DA）。分別根據(jù)評(píng)價(jià)模型質(zhì)量的3個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，即模型概括X矩陣解釋率R2X、建模穩(wěn)定性R2Y及模型預(yù)測(cè)性Q2，同采用200次響應(yīng)排序檢驗(yàn)（response permutation testing，RPT）和 CV-ANOVA 方差分析驗(yàn)證模型建立是否成功。以變量權(quán)重重要性排序（variable importance in projection，VIP）大于 1 為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異性變量[10-12]，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行Mann-Whitney U檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物模型

本課題組前期已對(duì)該動(dòng)物模型進(jìn)行了研究[9]，造模完成后72 h，解剖大鼠取血栓部位，分別通過(guò)HE染色和Masson染色對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示：模型組大鼠血栓呈紫紅色，形成穩(wěn)定，充滿管腔；假手術(shù)組和對(duì)照組大鼠沒(méi)有血栓形成，證明模型建立成功。

2.2 1H-NMR檢測(cè)結(jié)果

對(duì)照組、假手術(shù)組和模型組大鼠尿液的代表性1H-NMR譜圖如圖1所示。結(jié)果顯示，尿液中的小分子代謝物主要為氨基酸類（如亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺和纈氨酸等）、有機(jī)酸（甲酸、乳酸、醋酸和琥珀酸等）、脂類、糖等。

2.3 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析及差異代謝物尋找

對(duì)歸一化后的尿液數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，找出并剔除異常離散樣本。再對(duì)模型組、假手術(shù)組和對(duì)照組大鼠尿液樣本建立PLS-DA模型，如圖2A所示，三組樣本可以明顯分開(kāi)（R2X=0.478，R2Y=0.736，Q2=0.509）。200次響應(yīng)排序檢驗(yàn)結(jié)果如圖2B所示，回歸線斜率較大而且與縱軸的截距小于零，說(shuō)明模型質(zhì)量良好。CV-ANOVA方差分析結(jié)果顯示，模型的組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 模型組、假手術(shù)組和對(duì)照組大鼠尿液樣本代表性1H-NMR譜圖

圖2 模型組（▲）、假手術(shù)組（■）和對(duì)照組（●）大鼠尿液PLS-DA散點(diǎn)圖和RPT示意圖

為尋找與DVT高度相關(guān)的差異代謝物，對(duì)對(duì)照組和假手術(shù)組、對(duì)照組和模型組、假手術(shù)組和模型組尿液數(shù)據(jù)進(jìn)行兩組間分析，分別建立三個(gè)OPLS-DA模型，模型散點(diǎn)圖見(jiàn)圖3，模型參數(shù)見(jiàn)表1。對(duì)所建立的各個(gè)OPLS-DA模型進(jìn)行CV-ANOVA方差分析，結(jié)果顯示，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。以VIP＞1為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)照組和假手術(shù)組比對(duì)得到367個(gè)差異變量，對(duì)照組和模型組比對(duì)得到354個(gè)差異變量，假手術(shù)組和模型組比對(duì)得到452個(gè)差異變量（圖3D）。去除假手術(shù)組的影響后，得到如圖3D紅圈部分模型組與對(duì)照組相比發(fā)生變化的323個(gè)差異變量。再對(duì)這部分差異變量進(jìn)行Mann-Whitney U檢驗(yàn)，最終得到VIP值大于1且P＜0.05的72個(gè)差異變量，分別歸屬于11個(gè)差異代謝物（表2）。

表1 大鼠尿液樣本OPLS-DA模型評(píng)價(jià)指標(biāo)及CV-ANOVA分析

表2 大鼠DVT模型尿液中差異代謝物

3 討 論

本課題組前期已建立成熟的大鼠下腔靜脈完全結(jié)扎DVT模型[9-10]，該模型具有血栓形成穩(wěn)定、形成率較高、動(dòng)物存活率高、組間差異較小等特點(diǎn)，是目前深靜脈血栓研究方面最常用的動(dòng)物模型[13-15]，適用于深靜脈血栓形成的代謝組學(xué)研究。模型建立后2～3h開(kāi)始形成血栓，符合人體靜脈血栓形成急性期的病理變化；在48～72 h血栓形成最穩(wěn)定，此時(shí)尿液中小分子代謝物受血栓形成的影響最大，因此在本實(shí)驗(yàn)中選擇收集該時(shí)段大鼠尿液進(jìn)行代謝組學(xué)研究。該模型的缺點(diǎn)在于完全阻斷了下腔靜脈血流，只能模擬血栓完全阻塞血管的病例。

代謝組學(xué)作為后基因時(shí)代的一種新的組學(xué)技術(shù)，主要通過(guò)分析體內(nèi)內(nèi)源性代謝物的水平變化來(lái)反映機(jī)體目前所處的狀態(tài)[16]。在疾病的研究方面，代謝組學(xué)能夠幫助人們更好地理解病變過(guò)程和機(jī)體內(nèi)物質(zhì)的代謝途徑，發(fā)現(xiàn)疾病的生物標(biāo)志物，并輔助臨床診斷。因此，從代謝組學(xué)角度尋找特異、靈敏的生物標(biāo)志物，進(jìn)行早期針對(duì)性溶栓治療從而降低肺栓塞發(fā)生率及死亡率，也可以為溶栓治療的效果提供評(píng)價(jià)依據(jù)。

本研究應(yīng)用1H-NMR代謝組學(xué)方法研究了DVT大鼠尿液中的小分子代謝物譜，并建立PLS-DA模型對(duì)尿液中代謝物譜進(jìn)行判別，結(jié)果顯示DVT模型組、假手術(shù)組和對(duì)照組樣本之間完全分離，說(shuō)明該模型可以通過(guò)尿液中代謝物區(qū)分DVT和正常大鼠，為今后開(kāi)展臨床人體尿液樣本的判別提供參考。由表2可知，通過(guò)OPLS-DA模型結(jié)合U檢驗(yàn)篩選出11個(gè)差異代謝物，其中亮氨酸、谷氨酰胺、肌酸、肌酐和蔗糖在DVT大鼠尿液中含量增多，3-羥基丁酸、乳酸、丙酮、α-酮戊二酸、檸檬酸和馬尿酸在尿液中含量減少。3-羥基丁酸、乳酸和肌酸等參與急性缺氧的代謝產(chǎn)物的變化水平和BUJAK等[17]報(bào)道的急性PE模型血漿樣本中檢測(cè)到的變化相反，可能與動(dòng)物模型及樣本類型有關(guān)。其余差異代謝物主要與三羧酸循環(huán)、糖酵解、氨基酸代謝、脂肪酸代謝等多個(gè)能量代謝途徑有關(guān)。

目前，深靜脈血栓形成的實(shí)驗(yàn)室診斷主要依靠D-二聚體的檢測(cè)，其特點(diǎn)是靈敏度高，但特異性差[18]。其他正在研究中的生物標(biāo)志物如可溶性的血漿P-選擇素、炎性反應(yīng)因子、凝血因子Ⅷ、凝血酶族等的臨床價(jià)值尚不確定[19]。在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，對(duì)于肺動(dòng)脈主干的栓塞一般較容易鑒別，但對(duì)于極少數(shù)微小血栓造成大面積肺梗死引起的死亡在法醫(yī)病理學(xué)鑒定中存在一定困難。同時(shí)，尸體血液樣本中的D-二聚體等檢測(cè)也面臨很大的困難，而通過(guò)尸體尿液中代謝物差異的比較可以為此類案件鑒定提供幫助。因此，尋找可用于DVT輔助診斷的、準(zhǔn)確度和敏感性更好的生物標(biāo)志物是目前亟待解決的問(wèn)題。

本研究通過(guò)代謝組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)了一組大鼠尿液中的差異代謝物，與血液相比尿液樣本無(wú)創(chuàng)且容易獲取，大鼠尿液中的差異代謝物有望成為深靜脈血栓形成的候選生物標(biāo)志物，為該疾病的診斷、治療和法醫(yī)學(xué)鑒定提供研究基礎(chǔ)。但因大鼠和人體的種屬差異，能否應(yīng)用于臨床實(shí)踐，尚需進(jìn)一步對(duì)人體尿液的代謝組學(xué)進(jìn)行研究驗(yàn)證。