李敏，黃小梅，談文林

（1.達州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川達州635000；2.四川文理學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，四川達州635000；3.特色植物開發(fā)研究四川省高校重點實驗室，四川達州635000）

何首烏（Polygonum multiflorum Thunb）為蓼科植物何首烏的干燥塊根，長橢圓形，呈紅褐色至暗褐色[1-2]。中藥何首烏分為生首烏和制首烏，生首烏具有解毒（截瘧）、消癰、潤腸通便等功效；制首烏具有強筋骨、補益精血、補肝腎、烏須發(fā)等功效[3-5]。何首烏所含的蒽醌類、二苯乙烯苷類和磷脂類化合物是其藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[6]。蒽醌類化合物主要包括大黃素、大黃素甲醚、大黃酚、和大黃酸等化學(xué)成分，是何首烏中的主要活性物質(zhì)[7]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：蒽醌類化合物具有活血化瘀、抗菌消炎、調(diào)節(jié)免疫功能、保肝護肝、利尿和抗腫瘤等作用[8-10]。

目前何首烏蒽醌類物質(zhì)的提取方法主要有溶劑回流法、超聲波輔助提取法、大孔樹脂吸附法和微波提取法等[11-13]。超臨界CO2萃取技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種新型提取技術(shù)，具有對物質(zhì)結(jié)構(gòu)無損傷、無毒無殘留、速度快、提取效率高和易分離等優(yōu)點，特別適合天然藥物有效成分的分離[14-15]。本文以何首烏中的蒽醌類物質(zhì)為研究對象，采用超臨界CO2萃取技術(shù)提取得到蒽醌類物質(zhì)，利用紫外分光光度法對蒽醌類物質(zhì)進行檢測，通過超臨界CO2萃取條件篩選，正交試驗工藝優(yōu)化，得到蒽醌類物質(zhì)提取最佳工藝參數(shù)，同時將蒽醌類物質(zhì)的分離純化產(chǎn)物進行抗氧化活性檢測研究，為何首烏的綜合開發(fā)利用提供試驗技術(shù)支持。

圖1 大黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of measuring content of emodin

1 材料方法

1.1 材料與儀器

何首烏：四川達州產(chǎn)，45℃條件下恒溫干燥，粉碎后過篩，備用；大黃素標(biāo)準(zhǔn)試劑：中國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，用前干燥至恒重；S-8大孔樹脂：天津浩聚樹脂科技有限公司，用前進行預(yù)處理；VC、醋酸鎂、無水乙醇等其它試劑均為分析純；試驗用水為超純水。

SFE-2超臨界CO2萃取儀：美國ASI公司；R-1001VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；UV-2550紫外-可見分光光度計：日本島津公司；FA2004N電子天平：上海丙林電子科技有限公司；DZ-1AII真空干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；ZWF-110X50恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；F-500小型中藥粉碎機：新昌縣德科機械有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取經(jīng)干燥至恒重的大黃素標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，用無水乙醇溶解并定容至25 mL，搖勻得200 mg/L的對照儲備液。分別精密吸取對照儲備液0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL于25 mL容量瓶中，再加入1%的醋酸鎂顯色劑2.5 mL，搖勻使充分混合后顯色30 min，用無水乙醇定容，分別測定不同濃度在506 nm處的吸光度，至少檢測3次取平均值，以大黃素濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，繪制大黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖1所示。線性回歸方程y=0.031 5x+0.001 3，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，線性關(guān)系良好。

1.3 蒽醌類物質(zhì)提取及測定

準(zhǔn)確稱取過篩后的何首烏粉末200 g，裝入儀器中，設(shè)定好試驗所需萃取溫度、萃取壓力、萃取時間和夾帶劑含量等試驗儀器參數(shù)，進行試驗，收集提取產(chǎn)物，按1.2方法處理樣品后用無水乙醇定容，結(jié)合大黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過分光光度法進行樣品定性定量分析，按公式計算何首烏中蒽醌類物質(zhì)的提取率。

其中：C為蒽醌類物質(zhì)濃度，mg/L；V為萃取液體積，L；M 為何首烏質(zhì)量，g。

1.4 正交試驗

為進一步優(yōu)化超臨界CO2萃取中各因素對蒽醌類物質(zhì)提取效率的整體影響情況，對萃取溫度（A）、萃取壓力（B）、萃取時間（C）和夾帶劑含量（D）進行L9（34）正交試驗，方案設(shè)計見表1所示。

表1 因素水平表Table1 Factors and levels chart

1.5 蒽醌類物質(zhì)分離純化

將經(jīng)過預(yù)處理的S-8大孔樹脂裝入層析柱（Φ 30 mm×L 550 mm）中，將1.3中的提取液減壓濃縮后，用無水乙醇溶解，過濾、洗滌，再用蒸餾水定容，制成蒽醌類物質(zhì)濃度為0.65 mg/mL的上柱液，將450 mL上柱液以流速240 mL/h進行裝柱，先用100 mL石油醚和乙酸乙酯（體積比2∶1）混合洗脫劑洗脫，除掉蒽醌粗產(chǎn)物中色素和揮發(fā)油等極性較小的物質(zhì)，再用400 mL無水乙醇以流速80 mL/h洗脫，收集產(chǎn)品，減壓蒸餾，干燥，得精制蒽醌類化合物。

1.6 清除·OH活性檢測

由于H2O2氧化Fe2+，產(chǎn)生大量·OH，水楊酸與·OH顯色后在510 nm處有最大吸收，通過分光光度法檢測510 nm處吸光度，根據(jù)吸光度的變化，可以檢測·OH被清除的程度。在10 mL比色管中依次加入1 mL 0.1%的H2O2溶液，1 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液和1 mL不同濃度的精制蒽醌類化合物溶液，使其混合均勻后靜置5 min，然后加入1 mL 6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，用蒸餾水定容后在37℃條件下水浴30 min，510 nm處測定吸光度，計算蒽醌類物質(zhì)對·OH的清除率。

其中：E為清除率，%；A0為未加樣品的吸光度；A1為未加H2O2的吸光度；A2為加入樣品的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 萃取溫度對提取率的影響

在不含夾帶劑、CO2流量為35 kg/h、萃取壓力為20 MPa、萃取時間為2 h的條件下，分別討論了不同萃取溫度對提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 萃取溫度對提取率的影響Fig.2 The effect of extracting temperature on the extraction rate

由圖2可知，萃取溫度小于55℃時，隨著溫度的升高提取率迅速增大，萃取溫度達到55℃時，提取率達到最大值，之后，隨著溫度的升高，提取率有所下降。這是因為萃取溫度過低時，CO2呈亞臨界狀態(tài)對萃取不利，溫度升高有利于物料擴散對萃取有利；萃取溫度過高（超過55℃），CO2的密度和濃度降低，溶解能力下降對萃取不利，因此，根據(jù)試驗結(jié)果，選擇最適宜萃取溫度為55℃。

2.1.2 萃取壓力對提取率的影響

在不含夾帶劑、CO2流量為35 kg/h、萃取溫度為55℃、萃取時間為2 h的條件下，分別討論了不同萃取壓力對提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，提取率隨著萃取壓力的增大而增大，當(dāng)萃取壓力達到25 MPa時，提取率達到最大值，之后，隨著壓力的升高，提取率趨于穩(wěn)定。這是因為萃取壓力過低，CO2以亞臨界狀態(tài)存在不利于萃取，隨著壓力的增加，CO2的密度和濃度增加，被萃取物的溶解能力增強有利于萃取，萃取壓力過大，能量消耗增加，提取率趨于穩(wěn)定。因此萃取壓力控制在25 MPa為宜。

圖3 萃取壓力對提取率的影響Fig.3 The effect of extracting pressure on extraction rate

2.1.3 萃取時間對提取率的影響

在不含夾帶劑、CO2流量為35 kg/h、萃取溫度為55℃、萃取壓力為25 MPa的條件下，分別討論了不同萃取時間對提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 萃取時間對提取率的影響Fig.4 The effect of extracting time on extraction rate

由圖4可知，隨著萃取時間的延長，提取率不斷增大，有利于蒽醌類物質(zhì)的提取，當(dāng)萃取時間達到2 h時，提取率達到最大值，之后，隨著時間的延長，提取率趨于穩(wěn)定。故萃取時間控制在2 h為宜。

2.1.4 夾帶劑含量對提取率的影響

在CO2流量為35 kg/h、萃取時間為2 h、萃取溫度為55℃、萃取壓力為25 MPa的條件下，分別討論了無水乙醇夾帶劑含量對提取率的影響，結(jié)果如圖5所示。

從圖5可以看出，夾帶劑含量小于15%時，隨著夾帶劑含量的增加提取率迅速增大，夾帶劑含量達到15%時，提取率達到最大值，之后，隨著夾帶劑含量的增加，提取率有所下降。夾帶劑用量過大，萃取液量增大，后續(xù)處理復(fù)雜。因此確定最適宜夾帶劑含量為15%。

圖5 夾帶劑含量對提取率的影響Fig.5 The effect of entrainer content on extraction rate

2.2 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果和正交試驗因素水平表，以萃取溫度（A）、萃取壓力（B）、萃取時間（C）和夾帶劑含量（D）四因素為變量，進行L9（34）正交試驗，正交試驗結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果Table2 The results of orthogonal experiment

從表 2的極差試驗結(jié)果 RB＞RD＞RA＞RC分析可知，萃取壓力（B）對整體何首烏中蒽醌的提取率影響最大，其次是夾帶劑含量（D）和萃取溫度（A），最后是萃取時間（C）。由正交試驗中的k值得出最佳提取工藝為A2B2C3D2，即萃取溫度為55℃，萃取壓力為25 MPa，萃取時間為2.5 h，夾帶劑含量為15%。

2.3 驗證試驗

采用正交試驗的最佳提取工藝參數(shù)A2B2C3D2進行5次平行試驗，考察何首烏中蒽醌類物質(zhì)在最佳工藝參數(shù)條件下的提取率，其5次平行試驗的平均提取率為7.235 mg/g，試驗結(jié)果見表3所示。

表3 驗證試驗結(jié)果Table3 The results of verification experiment

2.4 抗氧化活性試驗

將精制何首烏蒽醌類化合物，用于清除·OH活性試驗，實現(xiàn)蒽醌類化合物的抗氧化活性研究。試驗過程與VC對比，按1.6方法進行，其試驗結(jié)果見圖6所示。

圖6 蒽醌類化合物和VC對·OH的清除能力Fig.6 Scavenging ability on OH·of anthraquinones and VC

從圖6中可以看出，在所選試驗濃度范圍內(nèi)，何首烏蒽醌類物質(zhì)與VC對·OH均有較強的清除能力，并隨著濃度的增加，·OH的清除能力不斷增強，相同濃度時，VC清除·OH的能力比蒽醌類物質(zhì)稍強?？梢?，何首烏蒽醌類物質(zhì)對·OH有較好的清除能力，具有較強的抗氧化活性。

3 結(jié)論

試驗以何首烏中蒽醌類物質(zhì)為研究對象，采用超臨界CO2萃取技術(shù)，探討了萃取溫度、萃取壓力、萃取時間和夾帶劑含量4個單因素對蒽醌類化合物提取效率的影響，通過正交試驗進行條件優(yōu)化，確定了超臨界CO2萃取何首烏中蒽醌類物質(zhì)的最佳工藝參數(shù)，即萃取溫度為55℃，萃取壓力為25 MPa，萃取時間為2.5 h，夾帶劑含量為15%，并通過驗證試驗進行驗證，提取率達到7.235 mg/g，實現(xiàn)了何首烏中蒽醌類物質(zhì)的有效提取。通過S-8大孔樹脂對提取物進行了分離純化，獲得了精制蒽醌類化合物，將純化產(chǎn)物應(yīng)用于清除·OH的抗氧化活性研究，試驗結(jié)果表明，何首烏蒽醌類物質(zhì)對·OH有較好的清除能力，具有較強的抗氧化活性。