雷霽卿，張放，楊金川，劉靈，馬立志，*

（1.貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州貴陽550005；2.貴陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州貴陽550005；3.貴州省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗局，貴州貴陽550005）

藍(lán)莓（Semen Trigonellae）又稱越橘，其果實呈藍(lán)色，VC、多酚及花色苷等營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，但蛋白質(zhì)含量較低[1]。隨著近年來藍(lán)莓種植面積在我國逐漸擴(kuò)大，使用藍(lán)莓釀造藍(lán)莓果酒成為研發(fā)藍(lán)莓深加工產(chǎn)品的一個熱點(diǎn)，而改善由于氮缺乏而引起的酒精發(fā)酵困難是目前藍(lán)莓果酒釀造過程中急需解決的關(guān)鍵問題。

在酒精發(fā)酵過程中，酵母優(yōu)先利用的氮源為銨態(tài)氮、游離 α-氨基酸（free amino nitrogen，F(xiàn)AN）和小分子多肽，被稱為酵母可同化氮素（yeast-assimilable nitrogen，YAN）[2-4]。過去的研究表明，低水平的 YAN（低于140 mgN/L）會降低酵母生長活性，從而導(dǎo)致葡萄酒發(fā)酵緩慢。為了解決這個問題，磷酸氫二銨（diammonium hydrogen phosphate，DAP）和游離 α-氨基酸（FAN）通常用作葡萄酒發(fā)酵活化劑。兩者作為直接的氮源添加劑會影響發(fā)酵過程中氨基酸代謝，從而導(dǎo)致生物胺、氨基甲酸乙酯、高級醇等發(fā)酵產(chǎn)物的含量受到影響[5-7]。生物胺不僅是評估果酒新鮮度和質(zhì)量的指標(biāo)，高含量生物胺可能會引起不良生理影響，如頭痛，低血壓，水腫和心悸等[8]，高濃度氨基甲酸乙酯則會導(dǎo)致胃腸道疾病并有致癌風(fēng)險[9-10]。因此，這些副產(chǎn)品的產(chǎn)生在釀造過程中非常重要。本研究采用貴州麻江種植藍(lán)莓為原料，比較不添加可同化氮果酒，添加不同濃度、不同種類可同化氮果酒中生物胺和氨基甲酸乙酯的含量差別，以期了解補(bǔ)充可同化氮對藍(lán)莓果酒安全性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 新鮮藍(lán)莓

采于貴州省麻江縣藍(lán)莓種植基地，選取成熟度一致、大小均勻、無病蟲害、表皮無破損的藍(lán)莓果實進(jìn)行果實可同化氮的測定，選取可同化氮含量最少的品種進(jìn)行實驗；釀酒酵母1203：中國食品發(fā)酵工業(yè)研究所。

1.1.2 試劑

麥芽汁培養(yǎng)基：上海博微生物科技有限公司；焦亞硫酸鉀：上海麥克林；磷酸氫二銨、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、氯化鈉、正丁醇、三氯乙酸：生工生物工程股份有限公司；氨基甲酸乙酯、D5-氨基甲酸乙酯、組胺鹽酸鹽、色胺、尸胺、酪胺鹽酸鹽、苯乙胺、腐胺、精胺、亞精胺、1，7-二氨基庚烷及丹磺酰氯（標(biāo)準(zhǔn)品）、正己烷、乙腈、乙酸、乙酸胺、乙酸乙酯、乙醚、甲醇、丙酮、正丁醇、三氯甲烷（色譜純）：美國西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；氨比色分析試劑盒（K740）：BioVision，Inc.；Cleanert EC氨基甲酸乙酯專用固相萃取柱：天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-25數(shù)顯酸度計：上海虹益儀器儀表有限公司；糖度計：日本atogo公司；氣浴恒溫振蕩器（THZ-92B氣浴恒溫震蕩搖床）：上海博迅實業(yè)有限公司；Agilent1260高效液相色譜儀、240-MS氣相色譜-質(zhì)譜儀：安捷倫科技有限公司；Agilent J&W DB-HeavyWAX氣相毛細(xì)管色譜柱、ZORBAX Eclipse Plus C18液相色譜柱：安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 總氮的測定

藍(lán)莓果實總氮的測定參照國標(biāo)GB 5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》中凱氏定氮法測定。

1.3.2 銨態(tài)氮的測定

藍(lán)莓果實銨態(tài)氮的測定使用Ammonia Colorimetric Assay Kit K470。

1.3.3 游離氨基酸的測定

藍(lán)莓果實游離氨基酸測定參照Vilanova M等的方法進(jìn)行[6]。

1.3.4 可同化氮添加方案

1.3.4.1 單添加可同化氮

藍(lán)莓果實測定游離氨基酸與銨態(tài)氮濃度之后，選擇游離氨基酸種類及數(shù)量最少的一種果實作為發(fā)酵原料，以磷酸氫二銨（DAP）作為可同化氮源分別添加0、130、270、400、540、670、800 mgN/L 進(jìn)行發(fā)酵，相應(yīng)發(fā)酵果酒分別編號為FCK、F1D、F2D、F3D、F4D、F5D、F6D；以游離氨基酸（FAN）作為可同化氮源分別添加0、130、270、400、540、670、800 mgN/L 進(jìn)行發(fā)酵，相應(yīng)發(fā)酵果酒分別編號為 FCK、F1A、F2A、F3A、F4A、F5A、F6A；氨基酸參照藍(lán)莓果實本身所含有的種類及其比例進(jìn)行添加[6]。

1.3.4.2 二次添加可同化氮的方案

一組發(fā)酵液添加DAP使其可同化氮濃度為270 mgN/L，發(fā)酵至第4天時再次添加130 mgN/L FAN使發(fā)酵液總添加可同化氮濃度達(dá)到400 mgN/L；一組發(fā)酵液添加銨態(tài)氮使其可同化氮濃度為400 mgN/L，發(fā)酵至第4天時再次添加140 mgN/L FAN使發(fā)酵液總添加可同化氮濃度達(dá)到400 mgN/L；一組發(fā)酵液添加FAN使其可同化氮濃度為270 mgN/L，發(fā)酵至第4天時再次添加130 mgN/L DAP使發(fā)酵液總添加可同化氮濃度達(dá)到400 mgN/L；一組發(fā)酵液添加FAN使其可同化氮濃度為400 mgN/L，發(fā)酵至第4天時再次添加140 mgN/L DAP使發(fā)酵液總添加可同化氮濃度達(dá)到400 mgN/L；以上4組發(fā)酵果酒相應(yīng)編號為F1DA、F2DA、F1AD、F2AD；氨基酸參照藍(lán)莓果實本身所含有的種類及其比例進(jìn)行添加[6]。

1.3.5 果酒發(fā)酵方法

參照張卿等[11]的方法進(jìn)行酵母培養(yǎng)與果酒發(fā)酵。

1.3.5.1 活化酵母

將凍存酵母菌在37℃融化，接種在5°Bx的麥芽汁培養(yǎng)基中活化，酵母與麥芽汁培養(yǎng)基的比例為1∶5，放在空氣恒溫振蕩器中28℃活化3 d，然后每天進(jìn)行傳代，連續(xù)3 d，使酵母處于活躍狀態(tài)。

1.3.5.2 發(fā)酵流程

選取成熟度一致、大小均勻藍(lán)莓洗凈→熱燙→勻漿→調(diào)配（pH=3.5，糖度=22°Bx）→添加偏重亞硫酸鉀滅菌→按比例接種酵母→添加可同化氮→恒溫28℃搖床培養(yǎng)3 d→暗處放置→過濾→酒精度與糖度的測定確定發(fā)酵結(jié)束。

1.3.6 氨基甲酸乙酯與生物胺的測定

果酒發(fā)酵14天后，放置于避光恒溫培養(yǎng)箱20℃低溫陳釀1個月后，測定氨基甲酸乙酯及生物胺含量。氨基甲酸乙酯含量的測定參照國標(biāo)GB 5009.223-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基甲酸乙酯的測定》。生物胺含量的測定參照國標(biāo)GB 5009.208-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中生物胺的測定》。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓果實總氮、銨態(tài)氮及游離氨基酸的測定

采集貴州麻將地區(qū)粉藍(lán)、園藍(lán)、燦爛共三個品種藍(lán)莓果實，進(jìn)行果實總氮含量、銨態(tài)氮含量、游離氨基酸含量及可同化氮含量的測定，見表1。

由表1試驗結(jié)果可知，園藍(lán)總氮[（389.920 0±4.525 5）mgN/L]及可同化氮[（97.469 1±0.493 9）mgN/L]含量最高，但游離氨基酸含量最低[（25.125 7±0.046 6）mgN/L]，進(jìn)一步測定果實中游離氨基酸種類，結(jié)果見表2。

由表2可知，3個品種藍(lán)莓果實均不含有賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）和脯氨酸（Pro），其中，園藍(lán)藍(lán)莓果實還缺少蛋氨酸（Met）及酪氨酸（Tyr）。

貴州地區(qū)藍(lán)莓果實可同化氮含量均低于100 mgN/L，因此添加可同化氮進(jìn)行藍(lán)莓果酒發(fā)酵可提高發(fā)酵效率，但可同化氮含量過高會伴隨生物胺及氨基甲酸乙酯的產(chǎn)生。氨基甲酸乙酯是發(fā)酵過程中乙醇與尿素、瓜氨酸自發(fā)反應(yīng)生成，生物胺是酵母所產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶將前體氨基酸脫羧產(chǎn)生，兩者的產(chǎn)生與初始發(fā)酵液中可同化氮濃度，氨基酸種類與數(shù)量關(guān)系密切[5-6]。為進(jìn)一步研究添加可同化氮種類及濃度對藍(lán)莓果酒中生物胺及氨基甲酸乙酯含量的影響，選擇氨基酸含量及種類最少的藍(lán)莓品種（園藍(lán)）作為發(fā)酵原料，采用DAP與FAN作為可同化氮源，進(jìn)行果酒發(fā)酵。

表1 不同藍(lán)莓果實可同化氮含量Table1 Concentration of assimilation nitrogen in different kinds of blueberry mgN/L

表2 不同藍(lán)莓果實游離氨基酸相對含量Table2 The relative content of free amino acids in different kinds of blueberry %

2.2 可同化氮濃度對藍(lán)莓果酒氨基甲酸乙酯的影響

測定分別添加不同濃度DAP或FAN果酒中氨基甲酸乙酯含量，試驗結(jié)果如圖1所示。

隨初始發(fā)酵液中可同化氮濃度增加，果酒中氨基甲酸乙酯含量升高，DAP作為氮源的藍(lán)莓果酒中氨基甲酸乙酯生成量隨可同化氮濃度增加迅速上升，在DAP濃度800mgN/L時可達(dá)到26.5μg/L，但仍小于國家限定標(biāo)準(zhǔn)（≤30 μg/L）；添加FAN作為氮源的藍(lán)莓果酒氨基甲酸乙酯的生成量隨可同化氮濃度增加而增加（1.53 μg/L～2.359 5 μg/L）；可同化氮濃度 130 mgN/L時，DAP或FAN果酒中氨基甲酸乙酯含量差別不大，但持續(xù)增加可同化氮濃度，添加DAP果酒中氨基甲酸乙酯含量遠(yuǎn)高于添加FAN果酒（圖1）。為進(jìn)一步探索可同化氮種類及含量對氨基甲酸乙酯的影響，進(jìn)行二次混合添加發(fā)酵試驗發(fā)現(xiàn)，二次添加可同化氮的藍(lán)莓果酒均未檢測到氨基甲酸乙酯。

圖1 可同化氮濃度對藍(lán)莓果酒氨基甲酸乙酯含量的影響Fig.1 The effect of assimilation nitrogen concentration on the content of ethyl carbamate of blueberry wine

圖2 可同化氮濃度對藍(lán)莓果酒生物胺含量的影響Fig.2 The effect of assimilation nitrogen concentration on the content of biogenic amine of blueberry wine

C.Adams等采用不同酵母株接種添加不同濃度DAP的葡萄汁進(jìn)行發(fā)酵后發(fā)現(xiàn)，可同化氮濃度對葡萄酒氨基甲酸乙酯含量的影響，取決于酵母菌株及添加可同化氮的時機(jī)：采用釀酒酵母522進(jìn)行發(fā)酵，則隨著DAP濃度增高，葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量增高；采用Pasteur Red酵母進(jìn)行發(fā)酵，則添加DAP反而使葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量減少；另外，采用釀酒酵母522進(jìn)行發(fā)酵時，初始發(fā)酵液添加DAP的葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量高于發(fā)酵開始后添加DAP的葡萄酒，采用Pasteur Red酵母進(jìn)行發(fā)酵則試驗結(jié)果相反[12]。張穎等采用葡萄酒高活性干酵母進(jìn)行模擬葡萄汁發(fā)酵發(fā)現(xiàn)添加DAP可使氨基甲酸乙酯含量降低，而添加氨基酸可使氨基甲酸乙酯含量升高[13]。本研究顯示，采用釀酒酵母1203進(jìn)行藍(lán)莓果酒發(fā)酵，隨初始發(fā)酵液中可同化氮濃度升高，果酒中氨基甲酸乙酯含量隨之增加，其他酵母菌種進(jìn)行發(fā)酵是否也會使添加可同化氮藍(lán)莓果酒氨基甲酸乙酯含量升高有待深入研究。

2.3 可同化氮濃度對藍(lán)莓果酒生物胺的影響

通過液相色譜測定果酒中生物胺種類及數(shù)量結(jié)果如圖2所示。

藍(lán)莓果酒生物胺苯乙胺、尸胺、組胺和精胺未檢出，色胺、腐胺、酪胺和亞精胺均有檢出，但酪胺與亞精胺相對含量較低。未添加可同化氮果酒中生物胺總含量最高，添加DAP或/和FAN使可同化氮濃度增加可有效減少生物胺的形成，二次添加可同化氮果酒生物胺總含量顯著高于相同濃度單次添加可同化氮的藍(lán)莓果酒[F1DA：（125.602 8±0.285 0）mg/mL、F1AD：（130.818 5±6.432 1）mg/mL、F3D：（27.844 2±0.586 9）mg/mL、F3A：（92.690 2 ±0.935 0）mg/mL；F2DA（101.5040±2.3550）mg/mL、F2AD（130.866 8±3.145 9）mg/mL、F4D：（94.084 8±1.694 0）mg/mL、F4A：（67.1349±0.2586）mg/mL]。

進(jìn)一步研究個別生物胺的含量變化，結(jié)果如圖3。

較添加FAN而言，添加DAP可更顯著降低色胺、亞精胺含量（圖3A、3D）；添加低濃度DAP果酒中腐胺含量低于添加低濃度YAN果酒，添加濃度超過400 mgN/L后，添加DAP果酒中腐胺含量急劇增加，添加YAN果酒則急劇下降（圖3B）；添加YAN可顯著降低酪胺含量，添加DAP濃度超過400 mgN/L時，酪胺含量大幅升高，可達(dá)（5.6032±0.1813）mg/mL（圖 3C）。

葡萄酒可檢出超過20種生物胺，主要含組胺、腐胺、酪胺[14]。本研究藍(lán)莓果酒中檢出色胺、腐胺、酪胺和亞精胺，以色胺和腐胺為主，果酒種生物胺含量及種類少于葡萄酒。比較藍(lán)莓果實與葡萄果實可知，葡萄汁含有至少18種游離氨基酸[1]，而園藍(lán)藍(lán)莓汁只含有11種游離氨基酸，缺少賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）、蛋氨酸（Met）及酪氨酸（Tyr）等氨基酸（表二），而生物胺含量與食品中存在的游離氨基酸關(guān)系密切[14-15]，故藍(lán)莓果酒生物胺種類與葡萄酒存在差異可能與游離氨基酸差別有關(guān)。同時，研究認(rèn)為蘋果酸-乳酸發(fā)酵發(fā)酵過程中產(chǎn)生了大量的生物胺，乳酸菌種類決定了添加可同化氮果酒中生物胺含量的增加或減少[14，16]，進(jìn)一步分離研究藍(lán)莓果酒蘋果酸-乳酸發(fā)酵過程中乳酸菌生理生化及發(fā)酵特性或許有助于揭示藍(lán)莓果酒生物胺變化規(guī)律的內(nèi)在機(jī)制。

圖3 可同化氮濃度對藍(lán)莓果酒各生物胺含量的影響Fig.3 The effect of assimilation nitrogen concentration on the content of different kinds of biogenic amine in blueberry wine

3 結(jié)論

本研究以藍(lán)莓果實為原材料，通過初始單添加不同濃度DAP或FAN以及二次混合添加DAP和FAN進(jìn)行果酒發(fā)酵試驗，首次探索了添加不同濃度、不同種類可同化氮對藍(lán)莓果酒中生物胺及氨基甲酸乙酯含量的影響。研究結(jié)果顯示，隨初始發(fā)酵液中可同化氮濃度增加，果酒中氨基甲酸乙酯含量升高，添加DAP果酒氨基甲酸乙酯含量顯著高于添加FAN果酒；二次添加果酒未檢測到氨基甲酸乙酯；隨初始發(fā)酵液中可同化氮濃度增加，果酒中生物胺含量減少，添加DAP果酒生物胺含量低于添加FAN果酒，單添加果酒生物胺含量低于二次添加果酒。本研究認(rèn)為藍(lán)莓果酒發(fā)酵添加可同化氮有助于降低生物胺含量，同時可同化氮添加濃度低于800 mgN/L時，果酒中氨基甲酸乙酯含量均符合國家安全限量標(biāo)準(zhǔn)。研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示可同化氮對藍(lán)莓果酒安全性影響及制定藍(lán)莓果酒可同化氮添加標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)。