王戎疆 張 立 佟向軍范六民 劉寶玉

（1北京大學生命科學學院 北京 100871 2北京師范大學生命科學學院 北京 100875 3天津市第一中學 天津 300051）

總分：100分

考試時間：90 min

共15題

本考題由3部分組成。

第1部分：質(zhì)粒的限制酶圖（48分）；

第2部分：基于PCR的酵母突變體基因分型（37分）；

第3部分：突變酵母的氨基酸營養(yǎng)缺陷（15分)。

任務1：

1）檢查材料和設備。

2）選擇限制酶。

3）孵育酶切反應。

4）配制瓊脂糖凝膠。

5）準備樣品并加載凝膠。

6）凝膠電泳*。

任務2：

7）拍攝凝膠照片及回答問題。

8）設置PCR反應。

9）PCR反應。

10）準備樣品并加載凝膠。

11）凝膠電泳*。

任務3：

12）拍攝凝膠照片及回答問題。

13）觀察和推論。

*注意：在操作時使用同一塊凝膠上不同的樣品孔。

材料和設備

現(xiàn)代生物技術(shù)作為21世紀的主要技術(shù)之一，它產(chǎn)生于食品研究，同時又很快被應用于食品生產(chǎn)。對于解決國家糧食危機，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品舉足輕重。但隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品對人們?nèi)粘Ｉ畹挠绊懖粩鄶U大，其安全性遭到質(zhì)疑。如何應對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，成了政府迫切需要解決的問題。目前，全球各國都在尋求一條有效途徑，來平衡兩者的沖突。如何用法律制度對其進行規(guī)制，已成為人類目前面臨的重要問題之一。

為了完成實驗工作，你需要下面列出的材料。請確?？梢垣@取這些材料。每位考生只有一份實驗材料，在考試過程中請謹慎操作。

請注意：1）為了完成分析，實驗中提供的所有液體試劑都超過了所需用量的2倍。在實驗過程中出現(xiàn)溢出或錯誤時，不提供附加材料（包括實驗器材和瓊脂糖凝膠）。2）為了在管底收集液體，請使用手冊中注明的技術(shù)。3）考試的目的之一是測試你的實驗工作技能。4）標簽上標有藍線的試管應一直保存在冰上。5）所有溶液都處于冷凍狀態(tài)，所以你必須在使用前對其進行解凍和混勻。

材料編號 數(shù)量 材料 在本試卷中需要使用的部分A 1 微量移液管 1～10 μL 1，2 B 1 微量移液管 20～200 μL 1，2 C 1 盒移液槍白槍頭 1～10 μL 1，2 D 1 盒移液槍黃槍頭 20～200 μL 1，2 E 1 PCR管架 1，2 F 1 1.5 mL 管架 1，2 G 5 1.5 mL管（有管蓋）2 H 2 0.2 mL PCR管（有管蓋，不要將管和蓋分開）1，2 I 1 12孔瓊脂糖凝膠（請勿打開包裝，直到你準備加載凝膠）1，2 J 1 OneRun電泳系統(tǒng)；緩沖液 1，2 K 1 記號筆 1，2 L 1 秒表／定時器 1，2 M 1 紙巾 1，2 N 1 一套塑料手套（在候考時發(fā)放）1，2 O 2 拉鎖袋（信封）1，2 P 1 含有8種不同培養(yǎng)基上生長的酵母照片的手冊 3 Q 1 用于生成各種氨基酸的生化反應圖（在工作區(qū)的墻上）3 R 1 1 Kb Plus DNA marker 1，2 S 1 聯(lián)系考務人員時所需的粉紅卡片 1，2，3 T 2 小型標簽 1，2 U 1 大標簽 1 V 1 540 μL 水 1，2

材料H：具有國家代碼和學生編號的ID標簽和試管

冰桶含有1.5 mL管和一套液體。

液體編號 數(shù)量 標簽 體積（μL）成分1 1 dNTP 60 dATP、dGTP、dcTP和dTTP 混合物2 1 DNApol緩沖液 140 DNA聚合酶緩沖液（5×）3 1 上樣緩沖液 100 加載緩沖液，用于瓊脂糖凝膠電泳4 1 引物A 30 引物對A 5 1 引物B 30 引物對B 6 1 引物C 30 引物對C 7 1 引物D 30 引物對D 8 1 引物E 30 引物對E 9 1 DNApol 14 脫氧核糖核酸聚合酶10 1 1 Kb marker 12 DNA marker，用于瓊脂糖凝膠電泳11 1 緩沖液1 8 緩沖液1（10×）12 1 緩沖液2 8 緩沖液2（10×）13 1 緩沖液3 8 緩沖液3（10×）14 1 模板WT 6 野生型模板DNA 15 1 突變體模板 6 突變體模板DNA 16 1 質(zhì)粒1 6 質(zhì)粒1 17 1 質(zhì)粒2 6 質(zhì)粒2 18 1 ApaI 6 ApaI限制酶19 1 EcoRI 6 EcoRI限制酶20 1 SmaI 6 SmaI限制酶

1 限制酶選擇（48分）

設計一個實驗以確定釀酒酵母中蛋白質(zhì)Alb的亞細胞定位。實驗策略要求將基因alb（999bp）與編碼2種不同熒光蛋白的序列融合。這是通過將基因克隆到2個質(zhì)粒骨架（pX和pZ）中實現(xiàn)的，最終可得到質(zhì)粒pX：alb和pZ：alb。用2個連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。純化來自2個大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒，得到“質(zhì)粒管1”和“質(zhì)粒管2”中的DNA。請確定2個管中包含有4個可能質(zhì)粒（pX，pX：alb，pZ或pZ：alb）中的哪2個（每個管中1個）。

問題1.DNA片段大小。（2分）

用標簽表示4種質(zhì)粒完全酶切獲得的DNA片段的預期大小。

限制酶及其最佳反應條件表

對2個質(zhì)粒進行嚴格的限制性內(nèi)切酶設計。

問題2.選擇限制性內(nèi)切酶。（4分）

你有3種限制酶可用：ApaI、EcoRI和SmaI。點擊這3種酶中的一種，可以區(qū)分4種可能的質(zhì)粒。請注意，長度小于100 bp的DNA片段將產(chǎn)生非常微弱的條帶，并且不能準確地確定它們的大小。

A.ApaI B.EcoRI C.SmaI

問題3.設計研究方案。（4分）

步驟：

1）分別用S1、S2、S3和S4標記0.2 mL PCR管。

2）設計酶切實驗，以確保使用所有2種質(zhì)粒，其中包含未切割質(zhì)粒DNA的對照。每個反應的總體積應為10 μL。典型的限制酶酶切包括：2 μL質(zhì)粒DNA，1 μL限制酶，1 μL緩沖液和加水至終體積為10 μL。

用整數(shù)表示添加到4個管中的每一種液體體積（所有量都以μL計）。如果不添加此特定成分，請寫入“0”。

S1（μL）S2（μL）（對照）S3（μL）S4（μL）（對照）質(zhì)粒管1質(zhì)粒管2 ApaI EcoRI SmaI 10 x緩沖液1 10 x緩沖液2 10 x緩沖液3水總?cè)莘e

問題4.酶切的反應條件。（2分）

繼續(xù)步驟：

3）按照問題2中的說明，混合限制性酶切反應的必要組分。

4）將移液器的體積設置為5 μL，并通過在每個管中上下吸打5～10次進行充分混合。始終保持移液管尖端在液體表面以下，避免產(chǎn)生氣泡。

5）將0.2 mL管放在小的拉鏈鎖袋中。關閉袋子，并將標簽上的ID號貼在包裝袋外面。

請指出你用于酶切的反應條件：

A.25℃ B.37℃

繼續(xù)步驟：

6）舉起你的粉紅色卡片與考務人員聯(lián)系，考務人員會將你的樣品送到所選的培養(yǎng)箱。完全酶切質(zhì)粒DNA需要15 min的孵育。

7）20 min后，你的粉紅色卡片會提示你收回樣品。

8）請檢查你是否收到了自己的樣品。

9）向每個樣品中加入3 μL加樣緩沖液。

10）通過上下吸打10次混合（避免產(chǎn)生氣泡）。

使用標準瓊脂糖凝膠電泳方法，通過凝膠電泳分析限制酶酶切的效果。

警告：電氣危險-RunOne電泳儀一旦啟動就不要移動。開始時，請勿將物品穿過設備蓋子的薄片加入。

警告：潛在的危險化學物質(zhì)。當處理瓊脂糖凝膠時，始終佩戴手套，因為它是與DNA結(jié)合染料一起預染的。

建議的操作流程：通過瓊脂糖凝膠電泳分析第1部分和/或第2部分的樣品。a.加載第1部分的樣品并運行15～20 min。b.停止設備。c.加載第2部分樣品。d.重新啟動設備，再運行15～20 min。

電泳方案：1）戴橡膠手套。2）將RunOne電泳室的蓋子抬起直立。3）從白色袋子包取出瓊脂糖凝膠準備進行電泳。拆下透明蓋子，并將凝膠從透明外殼小心地提起。小心處理凝膠，因為它容易斷裂。保留白色袋子供以后使用。4）檢查凝膠是否存在明顯的損壞，如裂縫/缺少孔或凝膠內(nèi)部有氣泡等。如果你發(fā)現(xiàn)此類問題，請立即通過舉起粉紅色卡片向考務人員報告。5）如下圖所示放置凝膠。

繼續(xù)操作步驟：

7）凝膠應完全浸沒在緩沖液中。如果不能，請考務人員提供適當?shù)膸椭?/p>

8）如下2個表（第1部分的樣品、第2部分的樣品)所述裝載瓊脂糖凝膠。加載3 μL 1 Kb marker、13 μL樣品（第1部分）和15 μL（第2部分）。

第1部分（1～5孔）

第2部分（6～12孔）

繼續(xù)電泳步驟：

9）將蓋子放在RunOne裝置上（有標簽的一面向下滑入電源盒）。

10）檢查電壓是否設置為100 V，否則使用“電壓選擇”按鈕。

11）按“運行/停止”按鈕打開電源，運行凝膠電泳15～20 min。請注意，你將無法看到通過凝膠實時遷移的DNA帶，但緩沖液中的藍色指示劑與300 bp DNA片段的遷移速度相同。

12）20 min后，按“運行/停止”按鈕關閉電源。

13）舉起你的卡片，考務人員將帶給你在瓊脂糖凝膠上查看DNA所需的設備，并記錄下來。

14）通過使用你的平板電腦和考務人員為你帶來的設備，將凝膠中的DNA帶記錄下來。考務人員將協(xié)助你進行記錄。

15）將托盤中的瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到燈臺上。

16）將黑色照片罩放在燈臺的頂部。

17）將平板電腦放在照相機的頂部，使透鏡向下指向室內(nèi)。

18）拍攝你的凝膠圖片。

問題5.拍照記錄你的DNA電泳結(jié)果。

拍攝DNA凝膠的3張照片。這些圖像將用于判斷你的PCR和限制酶酶切反應是否成功。

上傳你的3張凝膠圖像。

完成拍照，請將凝膠轉(zhuǎn)移到交付的白色袋子里。

問題6.使用限制酶酶切質(zhì)粒DNA。

在下圖中指出質(zhì)粒DNA是否已被添加的限制酶酶切。

現(xiàn)在請根據(jù)提供的標準凝膠圖片，對照你選擇的限制酶獲得的結(jié)果（問題3）。使用這張照片回答問題7和8。請注意，你只有在完成凝膠記錄后才可以使用標準圖片。

問題7.限制酶酶切的DNA片段大小。

如果在限制酶酶切中存在給定大小的DNA片段，則用標簽表示出來。

問題8.每管中質(zhì)粒的鑒定。

指示出每個管中存在哪些質(zhì)粒，不存在哪些質(zhì)粒。如果不能確定管中的質(zhì)粒存在與否，則在最后一列中用“+”表示。

2 基于PCR的基因組遺傳檢測（37分）

前期工作中已經(jīng)分離出突變體酵母菌株。這種酵母菌株在生長培養(yǎng)基中需要酪氨酸和苯丙氨酸才能繁殖。突變體在沒有色氨酸的培養(yǎng)基上生長的能力尚未測試。突變菌株的回交顯示僅單個基因受到了影響。你的任務是確定觀察到的營養(yǎng)缺陷的遺傳基礎。你可以使用5個引物對（下表）,每個引物對能檢測編碼芳香族氨基酸生物合成途徑中5種關鍵酶的基因的功能障礙（突變體）等位基因（下圖）。

可用的引物對及它們擴增的基因預期的DNA片段大小

用于形成芳香族氨基酸的生物合成途徑（左上：色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，假苯甲酸酯，分支酸鹽和莽草酸酯）及編碼途徑中各個酶的基因

問題9.選擇引物對。（5分）

通過結(jié)合5個引物對中2對可用引物（上表）的結(jié)果，可以確定在突變酵母菌株中觀察到的營養(yǎng)需求的遺傳基礎。

在下圖中指出選用的2個引物對（上表中A，B，C，D或E的組合）

步驟：

1）在1.5 mL管中制備PCR反應的混合物：196 μL水+70 μL DNA聚合酶緩沖液（5×）+35 μL dNTP+7 μL DNA聚合酶。

2）將移液管設置為100 μL，上下吹打5～10次。

3）找到0.2 mL PCR管標簽條，并粘貼在一個帶有ID號的小標簽上。

4）標記管1～6（不要將管條分離，否則你的樣品將不能參加PCR反應）。

5）將44 μL混合物平均轉(zhuǎn)移至6個PCR管中的每一個中。

6）對于管1～3，加入5 μL你選擇的第1個引物對。

7）對于管4～6，加入5 μL你選擇的第2個引物對。

8）向管1和4加入1 μL野生型模板DNA。

9）對于管2和5，加入1 μL突變體模板DNA。

10）對于管3和6，加入1 μL水。

11）在PCR程序中將移液管設定為45 μL，上下移動5～10次混合各個反應。關閉蓋子。

3個PCR程序（1～3）（結(jié)束后存儲在10°C）

問題10.選擇PCR程序。（2分）

請指出，如果引物溶解溫度（Tm）為60℃，DNA聚合酶可以以72 bp/s的速度在72℃下合成DNA，則3種PCR程序中哪一種（上表）能夠成功應用于擴增？

A.PCR程序1 B.PCR程序2 C.PCR程序3

重要提示：

1）請確保你按照步驟回答問題9和10。一旦你對答案表示確定，請點擊“LOCK ANSWERS”鎖定。注意：鎖定后，將無法再更改答案。

2）一旦你的答案被鎖定，請舉起卡片，考務人員將把你的樣品轉(zhuǎn)移到PCR儀。PCR程序需要20 min左右才能完成（此時可轉(zhuǎn)到第1部分或第3部分）。

3）20 min后,你的卡片將會提示送回你的樣品。

4）收到樣品后，請檢查它們是否為你的樣品。

5）準備將PCR樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，每個樣品中加入10 μL加樣緩沖液，并通過上下吹打5次混合均勻（避免產(chǎn)生氣泡）。

6）按照瓊脂糖凝膠電泳部分所述方法裝載樣品。

7）通過拍攝照片記錄凝膠（該凝膠的照片將被評估，最多可以獲得22分）。你現(xiàn)在將獲得一個標準的凝膠圖片，基于你以前選擇使用的引物對PCR分析。請使用這些信息回答問題11和12。注意：你只有在得到考務人員發(fā)回你的凝膠照片后，才能獲得標準的凝膠圖片。

問題11.DNA片段大小。（4分）

如果給定大小的所得DNA（bp）產(chǎn)物存在，則請在此處注明“+”，并逐列報告結(jié)果。

問題12.功能異常酶的分析。（4分）

根據(jù)你的結(jié)果，指出每種酶功能狀態(tài)。

3 突變酵母的氨基酸營養(yǎng)體分析（15分）

多年來，單倍體真菌釀酒酵母（面包酵母）已被用作模擬生物體，用于闡明真核生物中的新陳代謝過程。酵母通常能夠合成蛋白質(zhì)所需的全部20種氨基酸。在經(jīng)過UV-誘變后，研究人員已經(jīng)分離出各種氨基酸營養(yǎng)缺陷突變體。下面具有8張照片的手冊描繪了在8種不同培養(yǎng)基（A～H）上生長的單倍體釀酒酵母菌株1～5。位置1=無接種物，位置2=菌株1；位置3=菌株2；位置4=菌株3；位置5=菌株4；位置6=菌株5。板A～H的培養(yǎng)基組成在下表中給出。請注意：不要在照片上留下任何注釋。

培養(yǎng)基成分

問題13.菌株生長情況分析。（10分）

記錄各種菌株的生長或缺乏生長，用“+”表示生長，“-”表示不生長。

問題14.功能缺陷的酶的分析。（5分）

基于記錄的生長模式，推導出在5個菌株（1～5）中哪個或哪些最有可能存在功能缺陷的酶（如果有的話）。對于每個突變體，寫入功能缺陷酶所在步驟的數(shù)字（1～31）（見培養(yǎng)基成分表），如果沒有步驟功能失調(diào)，則填0。

考試結(jié)束。

（待續(xù)）