郭 薇 （大連市普通高中創(chuàng)新實(shí)踐學(xué)校 遼寧大連 116000）

PCR擴(kuò)增技術(shù)是人教版高中生物學(xué)選修1《生物技術(shù)實(shí)踐》中的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，是“多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段”一節(jié)的難點(diǎn)所在。筆者對(duì)該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行合理改進(jìn)，設(shè)置了具有現(xiàn)實(shí)意義的實(shí)驗(yàn)背景，優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)方案，使其更適于課堂教學(xué)組織。

1 學(xué)習(xí)內(nèi)容組織

1.1 PCR的原理 PCR是一種體外擴(kuò)增目的DNA的分子生物學(xué)技術(shù)。它以DNA為模板、引物為指導(dǎo)、多聚酶為工具、4種脫氧核糖核苷酸為原料，在特定的反應(yīng)條件下，經(jīng)變性、復(fù)性、延伸多個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增大量目的DNA以達(dá)到分析、檢測等實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。該技術(shù)的特點(diǎn)是快速、精確、高效、易操作。

作為最常用的PCR結(jié)果檢測方法，瓊脂糖凝膠電泳具有直觀、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，只需在完成電泳后，將瓊脂糖凝膠放置在凝膠成像儀中觀察，根據(jù)特異性條帶的有無、大小范圍，判斷實(shí)驗(yàn)成功與否，適用于教學(xué)開展。

1.2 PCR的應(yīng)用 作為一種重要的分子生物學(xué)技術(shù)，PCR被廣泛應(yīng)用于遺傳病診斷、古生物學(xué)研究、基因克隆和刑偵破案等多領(lǐng)域，具有極強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。開展此實(shí)驗(yàn)，既能培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)踐能力，又能幫助學(xué)生解決實(shí)際問題，增強(qiáng)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)興趣，獲取實(shí)驗(yàn)成就感。

1.3 PCR的操作 操作導(dǎo)圖見圖1。

圖1 操作導(dǎo)圖

2 學(xué)習(xí)目標(biāo)表述

1）知識(shí)目標(biāo)：簡述PCR技術(shù)在生活中的應(yīng)用。

2）能力目標(biāo)：使用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，也是本節(jié)課的教學(xué)重點(diǎn)和難點(diǎn)。

3）情感態(tài)度與價(jià)值觀目標(biāo)：養(yǎng)成合作探究精神和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度。

3 實(shí)驗(yàn)教學(xué)組織

為了更好地實(shí)現(xiàn)教學(xué)目標(biāo)，有效開展教學(xué)組織，筆者依據(jù)教材，將籠統(tǒng)問題具體化，對(duì)實(shí)驗(yàn)背景和實(shí)施方案進(jìn)行改進(jìn)完善。

3.1 實(shí)驗(yàn)背景 以刑偵破案作為實(shí)驗(yàn)背景。警方已從案發(fā)現(xiàn)場找到了少量嫌疑人的頭發(fā)，卻難以提取出大量的DNA用于嫌疑人性別分析，如何通過PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)性別鑒定，幫助警方破案？已知：人類女性的性染色體為XX型，男性為XY型，而Y染色體上有一段特異性的DNA序列，稱為“DYZ1”序列，它只存在于Y染色體上，是男性特有的DNA序列［1］。根據(jù)這一事實(shí)，若在DNA樣本上檢測出“DYZ1”序列，則可判斷嫌疑人為男性，反之為女性。

3.2 材料與儀器 性別鑒定試劑盒、微量移液器、微量離心管、移液器吸頭、離心機(jī)、渦旋混合儀、PCR儀和瓊脂糖凝膠電泳儀、凝膠成像儀等。

3.3 實(shí)驗(yàn)步驟

3.3.1 獲取模板DNA 以毛囊細(xì)胞中的DNA作為模板DNA，分別取1名男性和1名女性帶有毛囊的頭發(fā)各4根，分別置于2個(gè)0.5 mL離心管內(nèi)，男性標(biāo)為甲，女性標(biāo)為乙。

3.3.2 配制PCR反應(yīng)體系 利用PCR試劑盒中提供的“DYZ1”特異性引物對(duì)模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系中各成分用量如表1所示，總體積為20 μL。置于混合儀上數(shù)秒后，放入微量離心機(jī)，使反應(yīng)液集中在離心管底部。

表1 PCR反應(yīng)體系

3.3.3 設(shè)置PCR反應(yīng)程序 將已離心的甲、乙2個(gè)離心管放到PCR儀中，設(shè)置好循環(huán)條件后啟動(dòng)PCR儀，完成PCR擴(kuò)增。

循環(huán)條件為：預(yù)變性溫度95℃，保溫30 s；變性溫度95℃，保溫20 s，復(fù)性溫度52℃，保溫20 s，延伸溫度72℃，保溫20 s，循環(huán)次數(shù)為30次。

3.3.4 PCR結(jié)果檢測 稱量0.3 g瓊脂糖粉末，量取20 mL的1×TBE加熱溶解瓊脂糖（為避免加熱過程中溶液過度蒸發(fā)，實(shí)際可多量取3～5 mL的1×TBE），加入1 μL的GoldviewⅡ型核酸染料混合均勻。灌膠，待凝膠凝固后，分別取甲、乙2組PCR產(chǎn)物各10 μL，各與2 μL的6×上樣緩沖液混合，將混合液分別加入到2個(gè)上樣孔內(nèi)。

向電泳槽內(nèi)加1×TBE至剛剛沒過凝膠，調(diào)節(jié)電壓至4 V/cm，電泳20 min。電泳結(jié)束后，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖2所示，可清楚看出，在紫外燈照射下，甲有一條長度為500 bp左右的明亮DNA條帶，乙沒有任何條帶顯示。由此判斷，樣品甲PCR擴(kuò)增出的DNA片段與“DYZ1”片段大小吻合，即PCR產(chǎn)物是男性“Y”染色體上的“DYZ1”，而乙沒有擴(kuò)增出DNA片段。綜上所述，甲為男性，乙為女性，即實(shí)驗(yàn)結(jié)果與事實(shí)一致，實(shí)驗(yàn)可行。

5 改進(jìn)后的優(yōu)點(diǎn)

恰當(dāng)、易懂且具有針對(duì)性的實(shí)驗(yàn)背景能更好地激發(fā)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)熱情，加深學(xué)生對(duì)PCR理論知識(shí)的理解，幫助學(xué)生構(gòu)建清晰、確切的知識(shí)體系，且在設(shè)置實(shí)驗(yàn)背景的同時(shí)，明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，完善?shí)驗(yàn)方案，使PCR反應(yīng)體系及PCR反應(yīng)程序更加具體化，更具有針對(duì)性和可操作性，瓊脂糖電泳的檢測手段可使實(shí)驗(yàn)更加嚴(yán)謹(jǐn)。通過以上教學(xué)改進(jìn)，可大幅度減輕教師的工作負(fù)擔(dān)，提高教學(xué)效率。

教師在實(shí)驗(yàn)的教學(xué)組織中，不僅要引導(dǎo)學(xué)生完成實(shí)驗(yàn)任務(wù)，更需要幫助學(xué)生樹立嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度，所以實(shí)驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性和嚴(yán)謹(jǐn)性就尤為重要。筆者認(rèn)為，改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)在材料準(zhǔn)備、PCR條件建立以及結(jié)果檢測方法上，都更加完善，且本實(shí)驗(yàn)所需實(shí)驗(yàn)器材較少，實(shí)驗(yàn)藥品毒性極低［2］，對(duì)實(shí)驗(yàn)室也無特殊要求，適合在高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中開展。