趙華怡，千智斌

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院機能學實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院研究生2015級，河南 新鄉(xiāng) 453003)

穩(wěn)定的呼吸是機體存活的必要條件，哺乳動物呼吸性基本節(jié)律放電(rhythmic respiration discharge activity，RRDA)起源于延髓面神經(jīng)后核內(nèi)側(cè)區(qū)(the medial area of nucleus retrofacialis，mNRF)，它是呼吸運動得以產(chǎn)生的基礎(chǔ)[1-2]。黃體酮能夠在神經(jīng)系統(tǒng)分泌和合成，對神經(jīng)系統(tǒng)功能有著重要影響[3]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存在內(nèi)源性黃體酮和黃體酮受體，但相關(guān)研究主要集中在其對缺血再灌注損傷的保護作用[4-5]，黃體酮和黃體酮受體是否在生理條件下調(diào)節(jié)延髓呼吸中樞呼吸神經(jīng)元電活動尚未見報道，因此，作者設(shè)計本實驗，以新生大鼠離體延髓腦片為研究對象，使用神經(jīng)電生理方法從功能上研究在延髓呼吸中樞是否存在黃體酮受體和內(nèi)源性黃體酮調(diào)節(jié)RRDA和延髓呼吸中樞，為哺乳動物延髓呼吸中樞的發(fā)育和中樞性呼吸疾病的預(yù)防和治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物清潔級Sprague-Dawley大鼠購自河南省實驗動物中心(許可證號：SCXK 豫-2013-0002)，常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食，自然光照，實驗選取其生產(chǎn)的2日齡的新生大鼠24只，雌雄不拘。

1.2試劑與儀器黃體酮受體激動劑、黃體酮、黃體酮受體拮抗劑、米非司酮、人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)(配制成分為NaCl 124 mmol·L-1、KCl 5 mmol·L-1、CaCl22.4 mmol·L-1、NaHCO326 mmol·L-1、MgSO41.3 mmol·L-1、KH2PO41.2 mmol·L-1)均購于美國Sigma公司，30 mmol·L-1葡萄糖為國產(chǎn)分析純；BL-420生物信號采集與處理系統(tǒng)購自成都泰盟科技有限公司，體視顯微鏡購自濟南八一光學儀器廠，直流前置放大器(FZG-81)購自上海嘉龍教學儀器廠，數(shù)字測氧儀(CY-12C)購自上海隆拓儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1離體延髓腦片標本的制備取2日齡新生大鼠，吸入乙醚進行深度麻醉后，在第4～5頸椎斷頭處死，將鼠頭立即置于0 ℃的ACSF中清洗和降溫5～10 s，再轉(zhuǎn)移至含有200 mL 0 ℃ ACSF的解剖盒中，并持續(xù)通入含體積分數(shù)95%O2和體積分數(shù)5%CO2的混合氣。鼠頭固定在解剖槽中，使用眼科剪剝離顱骨的皮膚和肌肉組織，順延顱骨背側(cè)正中線緩慢剪開頂顱骨和椎管，并向尾端延伸直至完整剪開椎管，去除背側(cè)顱骨和椎骨，完全暴露大腦、小腦、腦干和脊髓。在游離出來的中樞神經(jīng)系統(tǒng)標本上去除小腦，完整暴露出延髓后在上下丘處切去高位腦組織，即完成延髓標本的制備。在延髓標本上第1～2頸椎間剪去脊髓尾端，刀刃垂直于脊髓在閂前后切出900～1 200 μm厚度的腦片，即完成腦片制備，腦片上保留有mNRF、橄欖核、舌下神經(jīng)根和背側(cè)呼吸組等結(jié)構(gòu)。為減少腦組織缺氧損傷，腦片制備時間控制在3 min以內(nèi)[6]。

1.3.2記錄腦片RRDA切好的腦片迅速轉(zhuǎn)移至灌流槽內(nèi)，保持腹側(cè)面朝上，灌流含有體積分數(shù)95%O2和體積分數(shù)5%CO2混合氣體的ACSF，流速4～6 mL·min-1，溫度為25～27 ℃。使用體視顯微鏡辨認腦片腹側(cè)面的舌下神經(jīng)根，使用含有銀-氯化銀保護電極的吸附電極加以負壓吸附舌下神經(jīng)根，記錄到的RRDA經(jīng)放大后通過BL-420F生物信號采集系統(tǒng)輸出，并對其處理和分析。

1.3.3實驗分組實驗分4組，每組6只腦片，分別進行灌注實驗。(1)對照組：使用空白ACSF灌流腦片，在灌流10 、20、30、40、50 min時測量RRDA，對各時間點的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理以檢測實驗?zāi)Ｐ偷姆€(wěn)定性，并以灌流10 min時的數(shù)據(jù)作為其他各組的對照；(2)黃體酮組：灌流含有不同濃度(5、10、20、40 μmol·L-1)黃體酮的ACSF，在灌流10 min時測量并分析RRDA的變化；(3)米非司酮組：灌流含有不同濃度(5、10、20、40 μmol·L-1)米非司酮的ACSF，灌流10 min時測量RRDA并分析其變化；(4)混合組：先灌流黃體酮(20 μmol·L-1)10 min，然后用空白ACSF沖洗腦片，再灌流黃體酮+米非司酮(20 μmol·L-1)10 min，對比單獨使用黃體酮10 min和混合使用黃體酮+米非司酮10 min時RRDA的變化情況。

1.4測量指標機體呼吸過程中，吸氣時程(inspiratory time，TI)、吸氣幅度(inspiratory strength，IA)和呼吸頻率(respiratory frequency，RF)是反映呼吸運動的參數(shù)，本研究同樣以上述3個參數(shù)作為判斷RRDA的指標。每次RRDA從放電開始至結(jié)束所持續(xù)的時間即為TI；每次呈簇狀的呼吸放電積分即為IA；每分鐘內(nèi)發(fā)生呼吸放電的次數(shù)即為RF。為使實驗結(jié)果更直觀，以對照組大鼠腦片灌流 10 min 時所測得的結(jié)果作為100%，對本組各時間點和其他各組不同濃度的數(shù)據(jù)進行標準化處理。

2 結(jié)果

2.1模型穩(wěn)定性結(jié)果見表1。對照組大鼠腦片在灌流10、20、30、40、50 min時各時間點TI、IA、RF比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明50 min內(nèi)灌流的腦片標本RRDA無衰弱現(xiàn)象，本模型具有可靠的穩(wěn)定性。

表1對照組不同時間點RRDA比較

時間TI/sIA/mVRF/(次·min-1)10 min100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.0020 min98.83±2.48103.17±5.05101.67±8.4330 min101.78±4.33102.40±6.2999.67±7.0740 min98.67±5.1698.67±5.6398.55±8.4450 min96.54±4.2198.33±4.2697.02±8.67F0.7510.8120.887P0.6800.6440.720

2.2不同濃度黃體酮對延髓腦片RRDA的影響結(jié)果見表2。對照組、黃體酮組灌注前和5 μmol·L-1黃體酮組TI、IA和RF比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與對照組、黃體酮組灌注前和5 μmol·L-1黃體酮組比較，10、20、40 μmol·L-1黃體酮組TI延長，IA增強，RF增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與10 μmol·L-1黃體酮組比較，20、40 μmol·L-1黃體酮組TI延長，IA增強，RF增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；40 μmol·L-1黃體酮組與20 μmol·L-1黃體酮組TI、IA和RF比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2不同濃度黃體酮對延髓腦片RRDA的影響

組別nTI/sIA/mVRF/(次·min-1)對照組6100.00±0.00 100.00±0.00 100.00±0.00 黃體酮組6 灌注前99.52±3.59102.67±4.83100.37±5.11 5 μmol·L-1組101.78±4.34102.17±3.56102.50±4.25 10 μmol·L-1組104.50±2.43a106.33±3.84a108.77±4.09a 20 μmol·L-1組117.67±5.49ab120.50±5.13ab115.39±5.85ab 40 μmol·L-1組116.38±5.32ab119.17±5.22ab117.20±4.46abF6.15210.0387.783P0.0010.0000.000

注：與對照組、黃體酮組灌注前和5 μmol·L-1黃體酮組比較aP<0.05；與10 μmol·L-1黃體酮組比較bP<0.05。

2.3不同濃度米非司酮對延髓腦片RRDA的影響結(jié)果見表3。對照組、米非司酮組灌注前和5 μmol·L-1米非司酮組TI、IA和RF比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與對照組、米非司酮組灌注前和5 μmol·L-1米非司酮組比較，10、20、40 μmol·L-1米非司酮組 TI縮短，IA降低，RF減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與10 μmol·L-1米非司酮組比較，20、40 μmol·L-1米非司酮組TI縮短，IA減弱，RF減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；40 μmol·L-1米非司酮組與20 μmol·L-1米非司酮組TI、IA和RF比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3不同濃度米非司酮對延髓腦片RRDA的影響

組別nTI/sIA/mVRF/(次·min-1)對照組6100.00±0.00 100.00±0.00 100.00±0.00 米非司酮組6 灌注前99.41±4.26101.29±4.40101.68±4.79 5 μmol·L-1組96.83±3.4095.33±3.02100.32±3.42 10 μmol·L-1組92.33±3.22a90.17±3.66a97.06±3.67a 20 μmol·L-1組84.00±3.20ab83.17±3.77ab90.81±4.21ab 40 μmol·L-1組83.16±5.63ab82.50±4.51ab90.95±5.06abF8.36710.5195.406P0.0000.0000.001

注：與對照組、黃體酮組灌注前和5 μmol·L-1黃體酮組比較aP<0.05；與10 μmol·L-1黃體酮組比較bP<0.05。

2.4黃體酮和黃體酮+米非司酮對延髓腦片RRDA的作用結(jié)果見表4。與對照組和混合組灌注前比較，混合組灌注黃體酮后TI延長，IA增強，RF增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與灌注黃體酮相比，灌注黃體酮+米非司酮后TI縮短，IA減弱，RF減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；對照組、混合組灌注前和灌注黃體酮+米非司酮后TI、IA和RF比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表4黃體酮和黃體酮+米非司酮對RRDA的影響

組別nTI/sIA/mVRF/(次/min-1)對照組6100.00±0.00 100.00±0.00 100.00±0.00 混合組6 灌注前98.57±5.32100.33±3.96100.67±5.24 灌注黃體酮后115.89±4.61a121.33±4.44a116.21±5.67a 灌注黃體酮+米非司酮后103.91±4.26b102.84±4.65b98.67±5.08bF11.90116.72620.243P0.0000.0000.000

注：與對照組和混合組灌注前比較aP<0.05；與灌注黃體酮后比較bP<0.05。

3 討論

哺乳動物完整的節(jié)律性呼吸起源于延髓呼吸中樞，是呼吸運動產(chǎn)生的基礎(chǔ)[7]。本實驗記錄的RRDA是由腦片mNRF區(qū)呼吸起步神經(jīng)元膜電位的周期性自動去極化產(chǎn)生，通過mNRF區(qū)呼吸神經(jīng)元換元過程將動作電位傳導至舌下運動神經(jīng)元，從而促進吸氣神經(jīng)元放電，這就是在舌下神經(jīng)根記錄到的電活動。因此，實驗過程中所記錄的RRDA反映了新生大鼠延髓呼吸中樞的呼吸功能，也間接反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和成熟情況[8]。

黃體酮又稱黃體酮或黃體激素，是外周神經(jīng)系統(tǒng)中由卵巢分泌的具有生物活性的主要孕激素。有關(guān)黃體酮在外周神經(jīng)系統(tǒng)的研究絕大多數(shù)集中在它作為孕激素方面，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的研究大多數(shù)集中在它對缺血再灌注損傷組織的保護作用[9-10]。近年來，黃體酮被作為一種內(nèi)源性信號分子得到研究，有研究發(fā)現(xiàn)，位于延髓背內(nèi)側(cè)即孤束核腹外側(cè)的去甲腎上腺素能神經(jīng)元上有黃體酮受體的表達；而在延髓腹外側(cè)區(qū)、小細胞性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和孤束核中同時存在黃體酮受體免疫反應(yīng)陽性細胞和黃體酮受體mRNA表達[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在5～20 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，黃體酮能夠增加TI和IA，增加RF，對RRDA呈濃度依賴性興奮作用，且20 μmol·L-1黃體酮為興奮RRDA的最適濃度，繼續(xù)增加黃體酮濃度對腦片RRDA無明顯改變；而黃體酮受體拮抗劑米非司酮能夠縮短TI和IA，減少RF，對RRDA呈濃度依賴性抑制作用，且20 μmol·L-1的米非司酮為抑制RRDA的最適濃度，繼續(xù)增加米非司酮濃度對腦片RRDA無明顯改變；單獨使用黃體酮對RRDA具有興奮作用，聯(lián)合使用黃體酮+米非司酮可完全阻斷黃體酮對RRDA的興奮作用。本研究結(jié)果提示，在新生大鼠離體延髓腦片內(nèi)有黃體酮受體激動劑黃體酮的存在，它可能由局部神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞分泌。黃體酮與黃體酮受體結(jié)合后能夠增加神經(jīng)元的興奮性，表現(xiàn)為RRDA增強[12]。使用黃體酮受體拮抗劑阻斷受體后導致黃體酮通過受體對神經(jīng)元所產(chǎn)生的興奮作用消失，從而使RRDA減弱。聯(lián)合使用黃體酮和米非司酮后對RRDA無明顯作用。以上實驗結(jié)果證實，黃體酮和米非司酮對RRDA的作用是通過受體途徑實現(xiàn)的。

黃體酮膜受體是經(jīng)典的Gq蛋白受體，被激活后可通過經(jīng)典途徑激活磷脂酶C，將細胞膜長鏈脂蛋白水解為磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(phosphatidylinositol biphosphate，PIP2)，PIP2被水解后產(chǎn)生三磷酸肌醇和二酰基甘油，前者通過與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的三磷酸肌醇受體結(jié)合，使鈣離子依賴性氯離子通道因細胞內(nèi)的鈣離子通道開放而得以激活；后者不僅能夠激活背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元上的蛋白激酶C通路，還可通過激活細胞內(nèi)鈣離子蛋白激酶C并使其發(fā)生磷酸化而增強活性，同時，對細胞內(nèi)大量蛋白質(zhì)的活性進行調(diào)節(jié)[13-15]。黃體酮受體被激活后除沿經(jīng)典的信號跨膜轉(zhuǎn)導途徑調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性外，也可通過黃體酮受體介導的電流調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性，黃體酮借助GABA受體的激活引起氯離子內(nèi)流，使細胞內(nèi)達到超極化狀態(tài)，降低神經(jīng)元的過度興奮性，還能抑制興奮性氨基酸的毒性作用，以維持神經(jīng)元正常的興奮性[16-17]。