張凡慶 ，陳玉雪 ，楊 亮 ，朱建國

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 上海 200240； 2.上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240； 3.上海富朗特動(dòng)物保健股份有限公司，上海201502）

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED） 是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemi c diarrhea virus，PEDV）感染引起的一種高度接觸性腸道傳染病。發(fā)病豬表現(xiàn)為水泄、嘔吐、脫水，甚至死亡［1］。各年齡段的豬都可以被感染，仔豬感染后癥狀最為嚴(yán)重，發(fā)病率和死亡率達(dá)到100%。PED最早在1971年英國的倫敦發(fā)生，之后在1978年才分離到第1株P(guān)EDV。我國在20世紀(jì)80年代首次出現(xiàn)了PED病情報(bào)道。該病在2010年以前為散發(fā)，沒有受到重視。2010年秋季以后，該病突然在我國出現(xiàn)了暴發(fā)，造成大量仔豬死亡，許多豬場甚至出現(xiàn)了沒有仔豬可養(yǎng)的狀態(tài)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2013年該病又傳播至美國，對(duì)美國養(yǎng)豬業(yè)造成了沉重的影響［2，3］。

PEDV屬于冠狀病毒科（Coronaviridae）， 冠 狀 病 毒 屬（Conronavirus）。病毒粒子呈圓形或橢圓形，具有囊膜，囊膜表面具有纖突。PEDV的基因組為28 000 nt，是目前已知的最大的動(dòng)物RNA病毒。PEDV基因組具有7個(gè)開放閱讀框（open reading frames，ORFs）， 編 碼四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和三個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白分別是纖突蛋白（Spike，S）、小膜蛋白（Envelope，E）、囊膜蛋白（Membrane，M）和核衣殼蛋白（Nucleocapsid，N）［4］。這些病毒蛋白在PEDV的黏附、入侵、復(fù)制、組裝、出芽和免疫逃避中發(fā)揮了重要的作用。

單鏈抗體（single chain fragment variable， scFv）是一種基因工程抗體，它是將抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過一個(gè)短的柔性肽段連接而成［5］。scFv保留了抗原結(jié)合活性，分子量僅為完整抗體分子的1/6。由于scFv只有抗體的Fc片段，避免了使用過程中的種屬問題。目前通常使用噬菌體單鏈抗體展示技術(shù)篩選抗體，該方法將編碼的scFv通過基因工程的方法與噬菌體外殼蛋白基因偶聯(lián)，使scFv被外殼蛋白攜帶并展示在噬菌體的表面，然后通過篩選富集方法獲得具有親和力和特異性的重組噬菌體。

本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的一株抗PEDV的scFv的生物學(xué)特性進(jìn)行了鑒定，并且在仔豬上研究了該scFv對(duì)PEDV的免疫保護(hù)效果，本研究對(duì)臨床預(yù)防和治療PEDV提供了一個(gè)思路。

1 材料與方法

1.1 毒株與細(xì)胞

PEDV上海崇明分離株由本實(shí)驗(yàn)室保存。非洲綠猴腎（Vero）細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

Ni-NTA His標(biāo)簽純化試劑盒購自美國Merck公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清（FBS）購自Gibco公司；FITC標(biāo)記小鼠抗His標(biāo)簽抗體、抗His標(biāo)簽小鼠單克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗購自Abcam公司；低熔點(diǎn)瓊脂糖購自Thermo公司；TPCK處理的胰酶購自上海生工生物公司。

2 方法

2.1 scFv的純化

從-40 ℃冰柜中取出凍存的抗PEDV scFv 菌株（scFv 與 pET-28a（＋）載體連接），在2 × YT-K固體培養(yǎng)基上劃線。第2天挑取單個(gè)菌落至液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。使用Ni-NTA His標(biāo)簽純化試劑盒進(jìn)行純化， Elute buffer洗脫蛋白。取少量純化后的蛋白進(jìn)行SDSPAGE分析。

2.2 scFv的特異性分析

取出實(shí)驗(yàn)室保存的PEDV、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、圓環(huán)病毒2型（PCV2）、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88和K99菌株，37 ℃包被96孔ELISA板。接著向每孔中加入純化的單鏈抗體 100 μL（10 μg/mL）， 孵 育 后 加入鼠抗His標(biāo)簽一抗、PBST洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗。最后加入TMB顯色液，在酶標(biāo)儀OD450nm處讀取數(shù)值。

2.3 scFv的免疫熒光實(shí)驗(yàn)

將 1.2 ×105TCID50/mL 的 TGEV感染六孔板中的ST細(xì)胞，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h。將ST細(xì)胞用4%多聚甲醛固定。依次加入scFv和FITC標(biāo)記的抗His標(biāo)簽二抗，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2.4 scFv對(duì)仔豬腹瀉的保護(hù)實(shí)驗(yàn)

取6頭21日齡長白仔豬，按以下處理分組。第1組1頭豬，為病毒處理組，先灌胃15 mL PBS，1 h后攻入2×106TCID50/mL的PEDV；第2組3頭豬，為scFv預(yù)防組，先灌胃15 mL濃 度 為 400 μg/mL的 scFv，1 h后攻入2×106TCID50/mL的PEDV；第3組1頭豬，用來評(píng)價(jià)scFv的生物安全性，先灌胃15 mL濃度為400 μg/mL的scFv，1 h后加入15 mL PBS；第4組1頭豬，為陰性處理組，先灌胃15 mL PBS，1 h后再灌為 15 mL PBS。

在實(shí)驗(yàn)的第2、4、7天觀察仔豬發(fā)病情況，記錄精神狀態(tài)、腹瀉情況和死亡數(shù)量。

分別采集發(fā)病死亡的豬以及第7天處死豬的小腸，用生理鹽水清洗內(nèi)容物后，取2～3 cm長的小腸組織置于10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋后制作切片，HE染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察其病理學(xué)變化。

2.5 scFv對(duì)仔豬的生物安全性評(píng)價(jià)

分別在感染后第2、4、7天采集仔豬糞便5 g，加入少量PBS后離心，取上清液。ELISA包被PEDV全病毒抗原2 μg/mL，包被封閉后加入提取的糞便上清液，檢測糞便中scFv的含量。

3 結(jié)果

3.1 抗豬流行性腹瀉病毒scFv的純化

將復(fù)蘇的菌株接種至含有50 μg/mL卡那霉素的2×YT培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.5時(shí)加入50 mmol的IPTG，30 ℃培養(yǎng)過夜。第2天收集離心的沉淀。使用超聲破碎儀破碎后，上清液加入Ni-NTA his標(biāo)簽蛋白純化樹脂，純化蛋白。10% SDSPAGE電泳結(jié)果顯示在28 ku有特異性條帶，證實(shí)scFv被成功純化（見圖1）。

圖1 scFv的SDS-PAGE電泳

3.2 scFv的免疫熒光實(shí)驗(yàn)

將1 MOI 的PEDV感染Vero細(xì)胞，24 h后加入4%多聚甲醛固定，接著加入封閉液和透化液，30 min后加入scFv，接著加入抗His標(biāo)簽的熒光二抗，結(jié)果顯示scFv加入后細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光，陰性對(duì)照組沒有出現(xiàn)熒光（圖2）。

圖2 scFv的免疫熒光實(shí)驗(yàn)

3.3 scFv的仔豬保護(hù)實(shí)驗(yàn)

將6頭仔豬分為攻毒組，scFv免疫組、scFv對(duì)照組和陰性對(duì)照組。在感染后第2、4、7 天觀察臨床癥狀，結(jié)果見表1。從表1可以看出，PEDV攻毒組在攻毒后出現(xiàn)腹瀉，癥狀逐漸加重，并且食欲減少。scFv免疫組處理后，腹瀉癥狀顯著減輕，并且食欲正常。scFv對(duì)照組證實(shí)scFv使用不會(huì)引起仔豬腹瀉。此外，所有組沒有出現(xiàn)仔豬的死亡。

表1 仔豬發(fā)病情況

圖3 HE染色切片

第7天剖檢仔豬，可見PEDV攻毒組仔豬腸道充滿內(nèi)容物和氣體，腸壁變薄。scFv免疫組仔豬腸道眼觀沒有變化。采集仔豬的小腸，石蠟包埋后染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PEDV攻毒組的仔豬小腸絨毛上皮脫落，有炎性細(xì)胞浸潤。scFv＋PEDV、scFv和陰性對(duì)照組則沒有出現(xiàn)腸道損傷，說明scFv處理能夠?qū)ψ胸i感染PEDV產(chǎn)生保護(hù)(見圖3)。

3.4 scFv的生物安全性評(píng)價(jià)

分別在感染后第2、4、7天采集仔豬糞便加入少量PBS懸浮，將離心的上清液進(jìn)行ELISA檢測。結(jié)果表明單鏈抗體處理的仔豬糞便中未檢測到scFv，說明制備的scFv具有生物安全性（見圖4）。

圖4 scFv的生物安全性評(píng)價(jià)

4 討論

PEDV屬于冠狀病毒科，感染各年齡段仔豬，臨床癥狀表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉和脫水。在2010年以前PEDV的預(yù)防以疫苗免疫為主，并取得了很好的效果。然而當(dāng)2010年的秋季疫情暴發(fā)后，傳統(tǒng)疫苗效果不佳，大量仔豬發(fā)病死亡［6］。之后的測序發(fā)現(xiàn)2010年流行株的基因發(fā)生了變異，傳統(tǒng)的疫苗不能提供保護(hù)，因此迫切需要針對(duì)新型流行株的免疫/治療制劑。本研究的單鏈抗體針對(duì)流行性PEDV毒株，因此具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

scFv具有特異性好，分子量低，能夠進(jìn)行改造等特點(diǎn)。目前scFv廣泛應(yīng)用于腫瘤、病原菌、毒素的診斷和治療。之前一些文獻(xiàn)報(bào)道了scFv對(duì)病毒也有抑制和治療作用。本文將實(shí)驗(yàn)室獲得的scFv進(jìn)行鑒定，證實(shí)該scFv具有中和病毒的效果。動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)證明，預(yù)先給仔豬口服scFv制劑后能夠阻斷病毒的入侵。本研究為scFv的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。