謝萬(wàn)祥,黃金平

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬隨州醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北 隨州 441300)

腎性貧血是慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，幾乎所有CKD 5期的患者均伴有不同程度的貧血。腎性貧血不僅嚴(yán)重影響尿毒癥患者生存質(zhì)量，而且增加心腦血管事件的發(fā)病率，進(jìn)而影響CKD患者預(yù)后[1]。腎性貧血的主要原因是腎臟促紅細(xì)胞生成素(EPO)不足和造血原料缺乏[2]。隨著重組人促紅細(xì)胞生成素(rh EPO)的問(wèn)世，大大改善了腎性貧血的糾正效果，幾乎終結(jié)了腎性貧血患者需要依賴異體輸血維持正常生理機(jī)能需求的治療方案。

但隨著rhEPO的普及，相關(guān)研究表明：約25%的透析患者使用常規(guī)劑量的EPO難以糾正貧血或需加大EPO的使用劑量(>200 IU·kg-1·week-1)才能維持目標(biāo)血紅蛋白值，這一類患者稱為EPO抵抗[3]。發(fā)生EPO抵抗的原因復(fù)雜且至今未明，自身體內(nèi)EPO抗體的形成、骨髓紅系祖細(xì)胞表面的 EPO 受體(EPO receptor)功能紊亂，以及體內(nèi)微炎癥狀態(tài)、鐵劑的缺乏均參與其中。而睪酮作為雄激素的主要成分，其受體廣泛分布于生殖系統(tǒng)、肌肉、皮膚、骨骼、心血管系統(tǒng)等。就造血而言，睪酮可通過(guò)刺激特定的核受體單元提高紅細(xì)胞增殖和集落形成單位刺激紅細(xì)胞的生成[4]，對(duì)再障性貧血，頑固性貧血具有一定療效，但國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)睪酮對(duì)腎性貧血影響及其作用機(jī)制的研究?；诖?，本研究自2015年10月至2016年10月觀察睪酮干預(yù)慢性腎功能衰竭大鼠后貧血糾正的療效，旨在發(fā)現(xiàn)治療腎性貧血的新途徑。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器 Olympus公司雙量程電子天平(北京賽多利斯有限公司)，電子恒溫水浴鍋(金壇市恒磊實(shí)驗(yàn)儀器廠)，低溫超速離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)，垂直電泳槽(北京六一儀器廠)，移液器(德國(guó)Eppendorf Easypet公司)，全自動(dòng)血液分析儀(美國(guó)Beckman公司)。

1.1.2藥品與試劑 丙酸睪酮注射液(上海通用藥業(yè)股份有限公司)，蛋白裂解液(美國(guó)BD， Biosciences)，聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)預(yù)制膠(Novex，san diego，CA)，EPO抗體(美國(guó)R&D Systems公司)，Marker(美國(guó)Fermentas公司)，anti-hepcidin(美國(guó)Bioss公司)，Hepcidin-Elisa(瑞士Bachen公司)。

1.1.3細(xì)胞與動(dòng)物 24只SPF級(jí)Wistar雄性大鼠，質(zhì)量200～220 g，購(gòu)于武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證：HBDW 201504-3。

1.2方法

1.2.1模型制備及分組 24只雄性大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)單位組設(shè)計(jì)組法分為對(duì)照組(NC)、正常大鼠睪酮干預(yù)組(NT)、慢性腎功能衰竭大鼠組(CD)、慢性腎功能衰竭大鼠睪酮治療組(CT)。每組6只。CD組、CT組大鼠給予腺嘌呤飼料(腺嘌呤含量0.75%)，NC組、NT組給予標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料。4周后CD組，CT組大鼠尾靜脈采血檢測(cè)血肌酐、血尿素氮判斷是否造模成功。造模成功后，NT組、CT組大鼠給予皮下注射丙酸睪酮(1 mg/100 μL芝麻油，每周2次)，NC組、CK組給予皮下注射芝麻油100 μL，每周2次，治療4周。

1.2.2標(biāo)本收集及研究方法 干預(yù)4周后麻醉處死大鼠，心臟采血，留取血標(biāo)本，留取腎臟、肝臟及十二指腸保存于-80 ℃冰箱用于下一步檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1大鼠一般情況及貧血相關(guān)指標(biāo)比較四組大鼠體質(zhì)量的基線水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，使用嘌呤飼料造模后，CD組、CT組大鼠生長(zhǎng)較NC組NT組遲緩，出現(xiàn)體質(zhì)量減輕，活動(dòng)減少，精神萎靡，動(dòng)作遲緩，毛發(fā)粗糙進(jìn)食飲水及尿量明顯增多等癥狀，所有大鼠均未見(jiàn)死亡。處死大鼠血液檢測(cè)顯示：與正常組大鼠相比， CD組大鼠血紅蛋白(Hb)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)，血清鐵(SI)，總鐵蛋白結(jié)合力(TIBC)明顯下降，呈現(xiàn)小細(xì)胞低色素貧血，缺鐵性貧血，使用睪酮治療后，上述指標(biāo)均顯著提升，大鼠貧血狀態(tài)糾正。見(jiàn)表1。

2.2大鼠腎臟病理NC組、NT組腎臟病理未見(jiàn)明顯異常，CD組可見(jiàn)輕到中度腎臟損害，表現(xiàn)為較正常組相比可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞肥大、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小管管腔擴(kuò)張且不規(guī)則等表現(xiàn)，而CT組病變表現(xiàn)輕于CD組，僅見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

2.3大鼠腎臟組織中EPO表達(dá)NC組、 NT組、 CD組、CT組大鼠腎臟中EPO的水平分別為(184.321±27.679)、(188.582±15.374)、(142.701±12.249)、(166.322±21.580) μg·g-1，CD組大鼠腎臟EPO表達(dá)顯著低于正常大鼠，經(jīng)丙酸睪酮治療后EPO表達(dá)明顯增加(P=0.013)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫蛋白印跡顯示：與對(duì)照組大鼠相比，CD組大鼠腎臟組織中EPO表達(dá)顯著減少，使用睪酮干預(yù)后，NT組較NC組相比EPO表達(dá)變化不顯著，但CT組較CD組大鼠腎臟內(nèi)EPO表達(dá)水平明顯增多。見(jiàn)圖2。

組別鼠數(shù)Hb/g·L-1RBC/106·mm-2HTC/%SI/mg·L-1TIBC/mg·L-1NC組6131.2±15.56.23±1.2241.33±5.724.82±1.038.27±2.33NT組6142.5±21.76.98±1.3747.23±5.895.36±1.228.50±3.21CD組6106.1±23.44.95±2.1426.31±6.283.57±1.145.87±3.04CT組6121.9±19.6a5.33±2.26a32.30±7.64a4.13±1.60a6.62±3.36aF值678.20266.53178.62156.23231.54P值0.000.000.000.000.00

注：與CD組比較，aP<0.05

2.4大鼠肝臟組織中鐵調(diào)素的表達(dá)免疫蛋白印跡顯示：與對(duì)照組大鼠相比，CD組大鼠肝臟組織中鐵調(diào)素表達(dá)顯著顯著增多，使用睪酮干預(yù)后，NT組較NC組，CT組較CD組大鼠肝臟內(nèi)鐵調(diào)素表達(dá)水平明顯下調(diào)。見(jiàn)圖3。

圖3 免疫蛋白印跡顯示4組大鼠肝臟組織中鐵調(diào)素表達(dá)情況

3 討論

腎性貧血是慢性腎衰竭患者最常見(jiàn)的并發(fā)癥，隨著慢性腎衰竭的進(jìn)展，貧血發(fā)生率，嚴(yán)重程度逐步上升。一項(xiàng)納入12 077例成年慢性腎臟病患者的研究[5]表明，在美國(guó)CKD1期患者腎性貧血的發(fā)病率為8.4%，而同人群CKD5期患者腎性貧血的發(fā)病率達(dá)53.4%。腎性貧血不僅嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，而且增加心血管疾病的發(fā)生率和死亡率。

腎性貧血的主要原因是EPO不足和造血原料(鐵)缺乏[5]。EPO是哺乳動(dòng)物調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的主要因子，90%由腎臟合成，促進(jìn)骨髓紅系祖細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和成熟[6]。隨著慢性腎衰竭的進(jìn)展，腎單位逐漸減少導(dǎo)致EPO合成減少。于此同時(shí)腎衰竭患者體內(nèi)鐵代謝發(fā)生紊亂，相關(guān)研究表明，透析患者每年經(jīng)慢性出血、透析丟失等途徑損失的鐵達(dá)1～3 g[7]。維持全身鐵平衡最主要的激素是鐵調(diào)素(hepcidin)，鐵調(diào)素由肝臟合成入血，通過(guò)結(jié)合鐵輸出細(xì)胞上膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，進(jìn)而導(dǎo)致鐵既不能從小腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)入血，也不能從網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中釋放而被再利用，最終抑制鐵劑的吸收[8]。

正常人體內(nèi)睪酮主要由男性睪丸或女性卵巢分泌，全身多器官組織均存在雄激素受體。Jill等[9]研究表明，在老年貧血患者中，血紅蛋白水平下降與睪酮下降水平相一致。而對(duì)于腎性貧血的患者，即使調(diào)整EPO達(dá)相同水平，低睪酮水平狀態(tài)下腎性貧血仍不能糾正。近年來(lái)雄激素及其相關(guān)衍生物如司坦唑醇、十一酸睪酮已經(jīng)開(kāi)始用于治療慢性再生障礙性貧血等一些血液系統(tǒng)疾病，并取得了較好的療效。那么不由假設(shè)，提升慢性腎衰竭患者體內(nèi)睪酮水平是否可以糾正腎性貧血？由此我們課題組設(shè)計(jì)了該實(shí)驗(yàn)。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：睪酮可提升慢性腎臟病腎性貧血大鼠體內(nèi)血清鐵含量，升高血紅蛋白值，糾正貧血。同時(shí)可降低大鼠肝臟內(nèi)鐵調(diào)素水平，升高腎臟內(nèi)EPO水平。睪酮糾正貧血的機(jī)制可能與降低鐵調(diào)素進(jìn)而增加腸道鐵的吸收與利用，同時(shí)升高EPO增加紅細(xì)胞合成相關(guān)。

迄今為止國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)睪酮對(duì)腎性貧血影響及其作用機(jī)制的研究，因此本研究使用腺嘌呤誘導(dǎo)CRF大鼠模型，研究睪酮對(duì)腎性貧血的影響，并對(duì)肝腎組織中鐵調(diào)素，EPO表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定，旨在闡明睪酮治療腎性貧血的可能機(jī)制，具備一定創(chuàng)新性，為腎性貧血的治療打開(kāi)新的思路。但本研究尚未研究不同性別大鼠對(duì)睪酮干預(yù)的影響，及使用睪酮治療后相關(guān)副作用等一些重要的問(wèn)題，擬在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究。

注：NC為對(duì)照組；NT為正常大鼠睪酮干預(yù)組；CD為慢性腎功能衰竭大鼠組；CT為慢性腎功能衰竭大鼠睪酮治療組

圖1四組大鼠腎臟病理典型圖片(HE×400)