鄒佳華，余昭勝，鄧光銳，余勝年，王嫻，韓秀文，汪井龍，付紅梅

(黃岡市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤中心，湖北 黃岡 438000)

肺癌是全球發(fā)病率與死亡率最高的惡性腫瘤，5年生存率只有13%，放射治療是肺癌重要治療手段之一[1-2]。放射性肺損傷是胸部腫瘤放射治療中的常見并發(fā)癥，因放射劑量提高導致放射性肺損傷臨床發(fā)生率為5%～36%，放射性肺損傷主要表現(xiàn)為炎癥，隨著放射次數(shù)的增加炎癥會逐漸導致肺纖維化，影響患者的肺功能，嚴重影響患者生活質量[3-4]。

放射性肺損傷發(fā)病機制目前認可度較高的有靶細胞理論、細胞因子學說和自由基觀點[5]?，F(xiàn)有的研究顯示，放射性肺損傷病理過程由多種細胞參與，如巨噬細胞、成纖維細胞、肺泡上皮細胞和血管內皮細胞，同時大量細胞因子參與其中，如轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)[6]。同時內源性和外源性活性氧也參與到放射性肺損傷的病理過程[7]。

以往的研究結論往往集中在臨床觀察及動物實驗研究，而對于體外細胞因子之間的相互聯(lián)系研究明顯不足。我們推測，放射性損傷早期以氧化應激損傷為主，進而激發(fā)炎癥反應，隨著急性炎癥的消退，逐漸轉向慢性炎癥甚至導致肺纖維化。已有的研究顯示，X射線可以引起A549非小細胞肺癌細胞產生大量的活性氧(ROS)[8]，抗氧化劑具有抑制A549的作用[9]。Turchan等[10]研究表明,經(jīng)X射線照射的人內皮祖細胞(hEPC)有很強的殺傷A549細胞的作用，這種作用與hEPC細胞分泌的TNF-α和TGF-β有關。

以往關于X射線對非小細胞肺癌的研究多集中在對腫瘤細胞的影響，而從氧化應激、炎癥、纖維化等方面研究X射線對巨噬細胞的影響較少。本研究自2014年10月至2015年12月以X射線照射小鼠RAW264.7為模型，探討氧化應激產生的ROS，炎性因子TNF-α，纖維化細胞因子TGF-β1之間的關系，研究結果將為從巨噬細胞角度闡釋放射性損傷氧化應激-炎癥-纖維化之間的關系，為從該方面的抗輻射藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細胞株RAW264.7細胞株，購自美國ATCC公司, 來源小鼠，屬于巨噬細胞。

1.2儀器Heal Force HF151UV CO2培養(yǎng)箱, Heal Force生物安全柜 (上海力申科學儀器有限公司) ;低溫高速離心機(Thermo scientific) ; Spectramax M2型酶標儀(Molecular Devices公司)。西門子Primus高能直線加速器。

1.3試劑RPMI Medium 1640，DMEM，胰蛋白酶，胎牛血清購自Gibco 公司。小鼠TNF-α, TGF-β1檢測試劑盒購自美國R&D公司。DCFH-DA， N-乙酰半胱氨酸(NAC) 購自碧云天。TNF-α抑制劑Lenalidomide(CC-5013) 購自Selleck(中國)；胰蛋白酶，購自Thermo Fisher Scientific Inc；硝酸纖維素(Nc)膜購自美國Whatman公司；預染蛋白Marker購自美國Progema公司；Nox2抗體購自美國Abcam；ECL檢測試劑購自美國GE公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。

1.4細胞培養(yǎng)RAW264.7細胞用RPMI 1640 培養(yǎng)液(含10% 胎牛血清) 培養(yǎng)，置37 ℃，5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5X射線照射RAW264.7細胞取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，以0.25%胰蛋白酶溶液消化細胞，制成單細胞懸液，計數(shù)，調整細胞濃度為1×108L-1。接種RAW264.7細胞于24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL細胞懸液，貼壁24 h后，分別給予不同的處理方式，對照組：用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，不做任何處理；X射線照射組：5 Gy組,10 Gy組。X射線采用西門子Primus高能直線加速器單次照射X射線5 Gy、10 Gy，照射參數(shù)為6 MV光子，計量率2.0 Gy·min-1，距細胞1 m。照射后不同時間收集細胞上清液檢測ROS, TNF-α,TGF-β1。

1.6ROS檢測將細胞等密度的接種于96孔板中，每孔100 μL，密度約為2×108L-1，置于溫箱培養(yǎng)24 h后，采用不同處理因素繼續(xù)干預細胞后，將96孔板中的培養(yǎng)基倒掉，更換為含有10 μmol·L-1DCFH-DA的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)孵育20 min，然后吸出培養(yǎng)基，用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA，最后再次加入PBS 100 μL，置于酶標儀下檢測，使用488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長。ROS水平(%)=干預組熒光值/對照組熒光值×100%。

1.7TNF-α和TGF-β1檢測采用ELISA試劑盒檢測細胞培養(yǎng)液上清中TNF-α和TGFβ1水平，酶標儀在450 nm處檢測吸光度值，參照標準曲線計算其濃度值，每個樣本做3復孔。

1.8Nox2檢測Western blot法檢測Nox2蛋白表達 不同處理方式后加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑后收集細胞，超聲破碎，離心(12 000 r·min-1，15 min，4 ℃)，取蛋白上清液進行蛋白含量測定。在SDS-PAGE凝膠中電泳，蛋白轉移到NC膜上，一抗Nox2孵育，經(jīng)洗膜、二抗孵育、洗膜后，最后顯影。

1.9活性氧清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)對X射線照射巨噬細胞ROS，TNF-α,TGF-β1影響取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，以0.25%胰蛋白酶溶液消化細胞，制成單細胞懸液，計數(shù)，調整細胞濃度為1×108L-1。接種RAW264.7細胞于24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL細胞懸液，貼壁24 h后，分為4組，對照組(不做任何處理)，X射線照射組(10 Gy)，NAC組，X射線聯(lián)合NAC組(其中NAC提前預處理2 h)，照射方式參照1.5。不同干預方式處理24 h后檢測ROS，TNF-α, TGF-β1，檢測方法參照1.6、1.7。

1.10TNF-α抑制劑Lenalidomide對X射線照射巨噬細胞ROS，TNF-α,TGF-β1影響取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，以0.25%胰蛋白酶溶液消化細胞，制成單細胞懸液，計數(shù)，調整細胞濃度為1×108L-1。接種RAW264.7細胞于24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL細胞懸液，貼壁24 h后，分為4組，對照組(不何處做任理)，X射線照射組(10 Gy)，Lenalidomide組，X射線聯(lián)合Lenalidomide組(其中Lenalidomide提前預處理2 h)，照射方式參照1.5。不同干預方式處理24 h后檢測ROS，TNF-α, TGF-β1，檢測方法參照1.6、1.7。

2 結果

2.1X射線照射對巨噬細胞ROS、TNF-α、TGF-β1影響與對照組相比，小鼠巨噬細胞RAW264.7單次(5 Gy、10 Gy) X射線照射后細胞培養(yǎng)上清液中ROS、TNF-α、TGF-β1依次在照射后12 、24、48 h達到最高 (圖1)。是否延長時間照射時間TGF-β1繼續(xù)升高，我們未進行檢測。從ROS，TNF-α, TGF-β1的研究結果，10 Gy X射線照射后24 h都發(fā)生顯著變化，因此后續(xù)實驗研究我們將選用10 Gy X射線照射后24 h作為的檢測條件。

注：A為ROS含量;B為TNF-α含量;C為TGF-β1含量

2.2NACX射線照射對巨噬細胞ROS、TNF-α、TGF-β1影響為了研究X射線照射ROS對巨噬細胞TNF-α、TGF-β1之間的影響，我們采用了活性氧清除劑NAC作為干預條件。使用3 mmol·L-1NAC后，ROS明顯受到抑制。同時TNF-α、TGF-β1均不同程度的下降。見圖2。

注：與對照組比較，aP<0.01; 與10 Gy比較，bP<0.01

2.3TNF-α抑制劑LenalidomideX射線照射對巨噬細胞ROS、TNF-α、TGF-β1影響為了進一步研究X射線照射TNF-α對巨噬細胞ROS、TGF-β1之間的影響，我們采用了TNF-α抑制劑Lenalidomide作為干預條件。使用2 μmol·L-1Lenalidomide后，TNF-α明顯受到抑制，同時TGF-β1均不同程度的下降，ROS未受到影響。見圖3。

注：與對照組比較，aP<0.01; 與10 Gy比較，bP<0.01

2.4X射線照射對小鼠RAW264.7巨噬細胞Nox2蛋白表達影響與對照組相比，5 Gy、10 Gy X射線照射小鼠RAW264.7巨噬細胞24 h，Nox2明顯上升。見圖4。

3 討論

電離輻射可以導致ROS的產生和DNA損傷，氧化細胞損傷及伴隨的DNA損傷會激活炎癥反應[11]。對于X射線輻射巨噬細胞的體外氧化應激-炎癥-纖維化研究未有明確的文獻報道。ROS是氧化應激重要的標志物，TNF-α是重要的炎性因子，TGF-β1是纖維化重要的細胞因子。本研究采用巨噬細胞為模型，觀察ROS、TNF-α、TGF-β1之間的關系，探討X射線導致的氧化應激-炎癥-纖維化之間的內在聯(lián)系，為X射線導致的纖維化提供體外依據(jù)，為X射線導致纖維化的藥物防治提供參考。

圖4 X射線照射對巨噬細胞Nox2表達的影響

本研究采用體外培養(yǎng)巨噬細胞RAW264.7后，采用X射線照射，發(fā)現(xiàn)RAW264.7細胞單次(5 Gy、10 Gy) X射線照射后細胞培養(yǎng)上清液中ROS在照射后12 h達到最高；RAW264.7細胞單次(5 Gy、10 Gy)X射線照射后細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α在照射后24 h達到最高；RAW264.7細胞單次(5 Gy、10 Gy) X射線照射后細胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1在照射后48 h達到最高。從ROS、TNF-α、TGF-β1產生的高峰時間，我們推測X射線照射后巨噬細胞首先發(fā)生氧化應激，隨后產生炎癥，繼而導致纖維化因子的產生，即X射線照射后激活ROS/TNF-α/TGF-β1通路。為了進一步明確我們的推測，我們進一步采用了ROS和TNF-α的抑制劑進行驗證。使用3 mmol·L-1活性氧清除劑NAC后，ROS明顯受到抑制。同時TNF-α、TGF-β1均不同程度的下降，提示X射線照射ROS是TNF-α, TGF-β1的上游。使用2 μmol·L-1Lenalidomide后，TNF-α明顯受到抑制，同時TGF-β1均不同程度的下降，ROS未受到影響，提示X射線照射TNF-α是TGF-β1的上游。

既往研究顯示感染誘導巨噬細胞分泌促炎細胞因子如TNF-α、IL-1β等，從而引發(fā)或加劇內質網(wǎng)應激，其機制可能與促進 Ca2+從內質網(wǎng)釋放和ROS積聚有關[12]。1995年Rubin 等首次提出“細胞因子學說”，認為射線會誘導炎性細胞因子產生[13]。放射性肺纖維化形成的病理機制非常復雜，當肺組織受到照射時，由于射線首先與肺組織中的水相互作用，產生ROS[14]。因此，在放射性損傷ROS可導致細胞炎癥，而感染可能是炎癥引起ROS生成?；谖覀兊难芯縓射線首先引起ROS的大量產生，繼而誘發(fā)炎癥。

體內產生活性氧的途徑很多，NADPH氧化酶是機體促活性氧生成的主要酶類之一，Nox2是NADPH氧化酶的亞型之一，主要在吞噬細胞、內皮和動脈外膜細胞中表達[15]。因此我們檢測了Nox2蛋白，發(fā)現(xiàn)X射線照射后Nox2蛋白顯著上升。我們初步認為， ROS的生產與Nox2密切相關，下一步我們將重點干擾Nox2，明確ROS的生成與Nox2直接相關，課題組正在構建Nox2 SiRNA穩(wěn)轉巨噬細胞株。

我們認為X射線照射導致巨噬細胞氧化應激，進而激活炎癥因子TNF-α表達，從而導致TGF-β1表達升高，因此我們認為抗氧化劑可能對巨噬細胞引起的氧化損傷及炎癥具有潛在的作用，甚至有可能對肺纖維化也有作用，抗氧化劑潛在治療肺纖維化的作用進一步確認將是我們下一步研究的重點。

邱騰穎等[16]使用8 Gy的X射線照射RAW264.7細胞后也發(fā)現(xiàn)巨噬細胞產生了大量TNF-α，與我們的研究具有一致性；研究同時發(fā)現(xiàn)NF-κB p65表達明顯升高，但對NF-κB 于TNF-α之間的關系未進行探討。NF-κB轉錄因子參與了X射線引起的巨噬細胞生物學變化，是否其他轉錄因子如STAT3也參與了該進程，需要進一步研究。同時，X射線照射巨噬細胞后分泌的相關因子是否會影響肺癌細胞的生長，影響成纖維細胞的生長，尚需進一步的細胞和動物實驗驗證。