鄒佳華，余昭勝，鄧光銳，余勝年，王嫻，韓秀文，汪井龍，付紅梅

(黃岡市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤中心，湖北 黃岡 438000)

肺癌是全球發(fā)病率與死亡率最高的惡性腫瘤，5年生存率只有13%，放射治療是肺癌重要治療手段之一[1-2]。放射性肺損傷是胸部腫瘤放射治療中的常見并發(fā)癥，因放射劑量提高導(dǎo)致放射性肺損傷臨床發(fā)生率為5%～36%，放射性肺損傷主要表現(xiàn)為炎癥，隨著放射次數(shù)的增加炎癥會(huì)逐漸導(dǎo)致肺纖維化，影響患者的肺功能，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[3-4]。

放射性肺損傷發(fā)病機(jī)制目前認(rèn)可度較高的有靶細(xì)胞理論、細(xì)胞因子學(xué)說和自由基觀點(diǎn)[5]?，F(xiàn)有的研究顯示，放射性肺損傷病理過程由多種細(xì)胞參與，如巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)大量細(xì)胞因子參與其中，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)[6]。同時(shí)內(nèi)源性和外源性活性氧也參與到放射性肺損傷的病理過程[7]。

以往的研究結(jié)論往往集中在臨床觀察及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，而對(duì)于體外細(xì)胞因子之間的相互聯(lián)系研究明顯不足。我們推測(cè)，放射性損傷早期以氧化應(yīng)激損傷為主，進(jìn)而激發(fā)炎癥反應(yīng)，隨著急性炎癥的消退，逐漸轉(zhuǎn)向慢性炎癥甚至導(dǎo)致肺纖維化。已有的研究顯示，X射線可以引起A549非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)[8]，抗氧化劑具有抑制A549的作用[9]。Turchan等[10]研究表明,經(jīng)X射線照射的人內(nèi)皮祖細(xì)胞(hEPC)有很強(qiáng)的殺傷A549細(xì)胞的作用，這種作用與hEPC細(xì)胞分泌的TNF-α和TGF-β有關(guān)。

以往關(guān)于X射線對(duì)非小細(xì)胞肺癌的研究多集中在對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響，而從氧化應(yīng)激、炎癥、纖維化等方面研究X射線對(duì)巨噬細(xì)胞的影響較少。本研究自2014年10月至2015年12月以X射線照射小鼠RAW264.7為模型，探討氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS，炎性因子TNF-α，纖維化細(xì)胞因子TGF-β1之間的關(guān)系，研究結(jié)果將為從巨噬細(xì)胞角度闡釋放射性損傷氧化應(yīng)激-炎癥-纖維化之間的關(guān)系，為從該方面的抗輻射藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞株，購自美國ATCC公司, 來源小鼠，屬于巨噬細(xì)胞。

1.2儀器Heal Force HF151UV CO2培養(yǎng)箱, Heal Force生物安全柜 (上海力申科學(xué)儀器有限公司) ;低溫高速離心機(jī)(Thermo scientific) ; Spectramax M2型酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司)。西門子Primus高能直線加速器。

1.3試劑RPMI Medium 1640，DMEM，胰蛋白酶，胎牛血清購自Gibco 公司。小鼠TNF-α, TGF-β1檢測(cè)試劑盒購自美國R&D公司。DCFH-DA， N-乙酰半胱氨酸(NAC) 購自碧云天。TNF-α抑制劑Lenalidomide(CC-5013) 購自Selleck(中國)；胰蛋白酶，購自Thermo Fisher Scientific Inc；硝酸纖維素(Nc)膜購自美國Whatman公司；預(yù)染蛋白Marker購自美國Progema公司；Nox2抗體購自美國Abcam；ECL檢測(cè)試劑購自美國GE公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞用RPMI 1640 培養(yǎng)液(含10% 胎牛血清) 培養(yǎng)，置37 ℃，5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5X射線照射RAW264.7細(xì)胞取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，以0.25%胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108L-1。接種RAW264.7細(xì)胞于24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL細(xì)胞懸液，貼壁24 h后，分別給予不同的處理方式，對(duì)照組：用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，不做任何處理；X射線照射組：5 Gy組,10 Gy組。X射線采用西門子Primus高能直線加速器單次照射X射線5 Gy、10 Gy，照射參數(shù)為6 MV光子，計(jì)量率2.0 Gy·min-1，距細(xì)胞1 m。照射后不同時(shí)間收集細(xì)胞上清液檢測(cè)ROS, TNF-α,TGF-β1。

1.6ROS檢測(cè)將細(xì)胞等密度的接種于96孔板中，每孔100 μL，密度約為2×108L-1，置于溫箱培養(yǎng)24 h后，采用不同處理因素繼續(xù)干預(yù)細(xì)胞后，將96孔板中的培養(yǎng)基倒掉，更換為含有10 μmol·L-1DCFH-DA的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)孵育20 min，然后吸出培養(yǎng)基，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，最后再次加入PBS 100 μL，置于酶標(biāo)儀下檢測(cè)，使用488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm發(fā)射波長(zhǎng)。ROS水平(%)=干預(yù)組熒光值/對(duì)照組熒光值×100%。

1.7TNF-α和TGF-β1檢測(cè)采用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TNF-α和TGFβ1水平，酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)吸光度值，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度值，每個(gè)樣本做3復(fù)孔。

1.8Nox2檢測(cè)Western blot法檢測(cè)Nox2蛋白表達(dá) 不同處理方式后加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑后收集細(xì)胞，超聲破碎，離心(12 000 r·min-1，15 min，4 ℃)，取蛋白上清液進(jìn)行蛋白含量測(cè)定。在SDS-PAGE凝膠中電泳，蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，一抗Nox2孵育，經(jīng)洗膜、二抗孵育、洗膜后，最后顯影。

1.9活性氧清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)對(duì)X射線照射巨噬細(xì)胞ROS，TNF-α,TGF-β1影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，以0.25%胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108L-1。接種RAW264.7細(xì)胞于24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL細(xì)胞懸液，貼壁24 h后，分為4組，對(duì)照組(不做任何處理)，X射線照射組(10 Gy)，NAC組，X射線聯(lián)合NAC組(其中NAC提前預(yù)處理2 h)，照射方式參照1.5。不同干預(yù)方式處理24 h后檢測(cè)ROS，TNF-α, TGF-β1，檢測(cè)方法參照1.6、1.7。

1.10TNF-α抑制劑Lenalidomide對(duì)X射線照射巨噬細(xì)胞ROS，TNF-α,TGF-β1影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，以0.25%胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108L-1。接種RAW264.7細(xì)胞于24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL細(xì)胞懸液，貼壁24 h后，分為4組，對(duì)照組(不何處做任理)，X射線照射組(10 Gy)，Lenalidomide組，X射線聯(lián)合Lenalidomide組(其中Lenalidomide提前預(yù)處理2 h)，照射方式參照1.5。不同干預(yù)方式處理24 h后檢測(cè)ROS，TNF-α, TGF-β1，檢測(cè)方法參照1.6、1.7。

2 結(jié)果

2.1X射線照射對(duì)巨噬細(xì)胞ROS、TNF-α、TGF-β1影響與對(duì)照組相比，小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7單次(5 Gy、10 Gy) X射線照射后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ROS、TNF-α、TGF-β1依次在照射后12 、24、48 h達(dá)到最高 (圖1)。是否延長(zhǎng)時(shí)間照射時(shí)間TGF-β1繼續(xù)升高，我們未進(jìn)行檢測(cè)。從ROS，TNF-α, TGF-β1的研究結(jié)果，10 Gy X射線照射后24 h都發(fā)生顯著變化，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究我們將選用10 Gy X射線照射后24 h作為的檢測(cè)條件。

注：A為ROS含量;B為TNF-α含量;C為TGF-β1含量

2.2NACX射線照射對(duì)巨噬細(xì)胞ROS、TNF-α、TGF-β1影響為了研究X射線照射ROS對(duì)巨噬細(xì)胞TNF-α、TGF-β1之間的影響，我們采用了活性氧清除劑NAC作為干預(yù)條件。使用3 mmol·L-1NAC后，ROS明顯受到抑制。同時(shí)TNF-α、TGF-β1均不同程度的下降。見圖2。

注：與對(duì)照組比較，aP<0.01; 與10 Gy比較，bP<0.01

2.3TNF-α抑制劑LenalidomideX射線照射對(duì)巨噬細(xì)胞ROS、TNF-α、TGF-β1影響為了進(jìn)一步研究X射線照射TNF-α對(duì)巨噬細(xì)胞ROS、TGF-β1之間的影響，我們采用了TNF-α抑制劑Lenalidomide作為干預(yù)條件。使用2 μmol·L-1Lenalidomide后，TNF-α明顯受到抑制，同時(shí)TGF-β1均不同程度的下降，ROS未受到影響。見圖3。

注：與對(duì)照組比較，aP<0.01; 與10 Gy比較，bP<0.01

2.4X射線照射對(duì)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞Nox2蛋白表達(dá)影響與對(duì)照組相比，5 Gy、10 Gy X射線照射小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞24 h，Nox2明顯上升。見圖4。

3 討論

電離輻射可以導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生和DNA損傷，氧化細(xì)胞損傷及伴隨的DNA損傷會(huì)激活炎癥反應(yīng)[11]。對(duì)于X射線輻射巨噬細(xì)胞的體外氧化應(yīng)激-炎癥-纖維化研究未有明確的文獻(xiàn)報(bào)道。ROS是氧化應(yīng)激重要的標(biāo)志物，TNF-α是重要的炎性因子，TGF-β1是纖維化重要的細(xì)胞因子。本研究采用巨噬細(xì)胞為模型，觀察ROS、TNF-α、TGF-β1之間的關(guān)系，探討X射線導(dǎo)致的氧化應(yīng)激-炎癥-纖維化之間的內(nèi)在聯(lián)系，為X射線導(dǎo)致的纖維化提供體外依據(jù)，為X射線導(dǎo)致纖維化的藥物防治提供參考。

圖4 X射線照射對(duì)巨噬細(xì)胞Nox2表達(dá)的影響

本研究采用體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞RAW264.7后，采用X射線照射，發(fā)現(xiàn)RAW264.7細(xì)胞單次(5 Gy、10 Gy) X射線照射后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ROS在照射后12 h達(dá)到最高；RAW264.7細(xì)胞單次(5 Gy、10 Gy)X射線照射后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α在照射后24 h達(dá)到最高；RAW264.7細(xì)胞單次(5 Gy、10 Gy) X射線照射后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1在照射后48 h達(dá)到最高。從ROS、TNF-α、TGF-β1產(chǎn)生的高峰時(shí)間，我們推測(cè)X射線照射后巨噬細(xì)胞首先發(fā)生氧化應(yīng)激，隨后產(chǎn)生炎癥，繼而導(dǎo)致纖維化因子的產(chǎn)生，即X射線照射后激活ROS/TNF-α/TGF-β1通路。為了進(jìn)一步明確我們的推測(cè)，我們進(jìn)一步采用了ROS和TNF-α的抑制劑進(jìn)行驗(yàn)證。使用3 mmol·L-1活性氧清除劑NAC后，ROS明顯受到抑制。同時(shí)TNF-α、TGF-β1均不同程度的下降，提示X射線照射ROS是TNF-α, TGF-β1的上游。使用2 μmol·L-1Lenalidomide后，TNF-α明顯受到抑制，同時(shí)TGF-β1均不同程度的下降，ROS未受到影響，提示X射線照射TNF-α是TGF-β1的上游。

既往研究顯示感染誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β等，從而引發(fā)或加劇內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，其機(jī)制可能與促進(jìn) Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放和ROS積聚有關(guān)[12]。1995年Rubin 等首次提出“細(xì)胞因子學(xué)說”，認(rèn)為射線會(huì)誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生[13]。放射性肺纖維化形成的病理機(jī)制非常復(fù)雜，當(dāng)肺組織受到照射時(shí)，由于射線首先與肺組織中的水相互作用，產(chǎn)生ROS[14]。因此，在放射性損傷ROS可導(dǎo)致細(xì)胞炎癥，而感染可能是炎癥引起ROS生成?；谖覀兊难芯縓射線首先引起ROS的大量產(chǎn)生，繼而誘發(fā)炎癥。

體內(nèi)產(chǎn)生活性氧的途徑很多，NADPH氧化酶是機(jī)體促活性氧生成的主要酶類之一，Nox2是NADPH氧化酶的亞型之一，主要在吞噬細(xì)胞、內(nèi)皮和動(dòng)脈外膜細(xì)胞中表達(dá)[15]。因此我們檢測(cè)了Nox2蛋白，發(fā)現(xiàn)X射線照射后Nox2蛋白顯著上升。我們初步認(rèn)為， ROS的生產(chǎn)與Nox2密切相關(guān)，下一步我們將重點(diǎn)干擾Nox2，明確ROS的生成與Nox2直接相關(guān)，課題組正在構(gòu)建Nox2 SiRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞株。

我們認(rèn)為X射線照射導(dǎo)致巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激，進(jìn)而激活炎癥因子TNF-α表達(dá)，從而導(dǎo)致TGF-β1表達(dá)升高，因此我們認(rèn)為抗氧化劑可能對(duì)巨噬細(xì)胞引起的氧化損傷及炎癥具有潛在的作用，甚至有可能對(duì)肺纖維化也有作用，抗氧化劑潛在治療肺纖維化的作用進(jìn)一步確認(rèn)將是我們下一步研究的重點(diǎn)。

邱騰穎等[16]使用8 Gy的X射線照射RAW264.7細(xì)胞后也發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生了大量TNF-α，與我們的研究具有一致性；研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)NF-κB p65表達(dá)明顯升高，但對(duì)NF-κB 于TNF-α之間的關(guān)系未進(jìn)行探討。NF-κB轉(zhuǎn)錄因子參與了X射線引起的巨噬細(xì)胞生物學(xué)變化，是否其他轉(zhuǎn)錄因子如STAT3也參與了該進(jìn)程，需要進(jìn)一步研究。同時(shí)，X射線照射巨噬細(xì)胞后分泌的相關(guān)因子是否會(huì)影響肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，影響成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，尚需進(jìn)一步的細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。