潘宣圳 曾曉春 劉偉璐 劉志華 王金杰 范海娟

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

木霉菌無性階段為木霉屬(Trichoderma)，有性階段為肉座菌屬(Hypocrea)[1]，廣泛存在于多種生態(tài)系統(tǒng)中[2]。大多數(shù)木霉菌具有生長迅速，適應(yīng)能力強，環(huán)境友好的特點。目前已經(jīng)報道的木霉菌有250多種[3]，包含許多對農(nóng)林業(yè)發(fā)展非常重要的植物病害生物防治菌，譬如哈茨木霉(T.harzianum)、棘孢木霉(T.asperellum)、深綠木霉(T.atroviride)、綠木霉(T.virens)等。生防木霉菌通過競爭、抗生、重寄生和誘導(dǎo)植物抗性等多種機制對至少18個屬29種植物病原真菌有拮抗作用[4]。生防木霉不僅可用于植物生長期病害防護，也可用于果蔬及園林植物材料的儲運保鮮和儲藏期病害防護[5-6]。在抗病的同時，生防木霉還能促進植物生長和提高土壤肥力[1,7]。所以，木霉資源的收集鑒定及生防能力測試對生防木霉的開發(fā)應(yīng)用具重要價值。小白菜(Brassicachinensis)是十字花科蕓薹屬蔬菜，營養(yǎng)豐富，生長周期短，是非常適合東北種植的設(shè)施蔬菜。種植過程中，病害、化肥超量施用、農(nóng)藥殘留、重金屬污染都會降低其品質(zhì)并影響其生長速度。而木霉能改善小白菜品質(zhì)，同時也促進其生長[8-10]。本研究將哈爾濱本地分離的1株木霉，經(jīng)平板抑菌檢測后固體發(fā)酵，探索其對小白菜的促生長作用，旨在開發(fā)一種東北地區(qū)適用的促小白菜生長的木霉菌劑。

1 材料與方法

1.1 菌株及植物材料

以東北林業(yè)大學(xué)城市林業(yè)示范基地野生益母草(Leonurusjaponicus)根際土為材料進行木霉分離。拮抗指示菌楊葉枯病菌(Alternariaalternata)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、楊樹爛皮病菌(Cytosporachrysosperma)由東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院保存。小白菜種子由甘肅武威市蔬菜種苗研究所育種。

1.2 培養(yǎng)基

孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5.00 g，葡萄糖10.00 g，磷酸二氫鉀1.00 g，硫酸鎂(無水)0.50 g，瓊脂20.00 g，孟加拉紅0.03 g，氯霉素0.10 g，蒸餾水1 L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水1 L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

PD培養(yǎng)基：PDA中不加瓊脂。

Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB)：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH值為7.4～7.6，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

LB液體培養(yǎng)基：LB中不加瓊脂。

1.3 木霉的分離鑒定

采集益母草根際土樣[11]，系列稀釋后涂布于無菌孟加拉紅平板。28 ℃培養(yǎng)3 d后，挑取其上疑似木霉的單孢菌落，轉(zhuǎn)接到PDA斜面，28 ℃培養(yǎng)7 d后，置于冰箱中4 ℃保存，菌株縮寫為Lj。

將純化的Lj轉(zhuǎn)接到PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)，觀察描述菌落特征、生長速度。另，采用插片法[12]進行形態(tài)學(xué)鑒定。

將Lj孢子接入PD培養(yǎng)基，28 ℃振蕩培養(yǎng)48 h，過濾收集菌絲體。用CTAB法提取菌絲體DNA，PCR擴增其ITS序列[13]。純化后ITS連入pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞。挑單克隆LB液體培養(yǎng)，PCR驗證為陽性后送上海生工測序。所得序列用TrichOKEY[14]和TrichoBLAST[15]在線軟件進行木霉鑒定。

1.4 木霉Lj菌株對植物病原真菌的抑制作用檢測

在Lj和供試植物病原真菌的PDA平板分別打孔獲得菌餅(d=5 mm)，轉(zhuǎn)接到新鋪制的PDA平板，二者相距6 cm，分別以每皿接種1和2個植物病原真菌菌餅的平板為對照1和對照2。每個試驗6次重復(fù)，接菌后平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后，用十字交叉法測量植物病原菌菌落半徑，計算抑菌率[12]。

1.5 木霉Lj菌株對小白菜促生作用測定

對Lj進行固態(tài)發(fā)酵[16]，產(chǎn)物用自來水稀釋，孢子濃度為109、108、107、106個·mL-1，分別灌土后播種催芽2 h的小白菜，以澆灌等量自來水的小白菜為對照，每濃度3個重復(fù)。在播種后15、30、45 d測小白菜葉長、根長、鮮質(zhì)量。取15 d第1、2真葉，30 d第3真葉，45 d第5真葉，蒸餾水洗凈吸干表面水份后-80 ℃凍藏，用以測定葉綠素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)和過氧化物酶(POD)活性。葉綠素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)和POD活性檢測均使用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的相應(yīng)試劑盒。

數(shù)據(jù)分析時，葉綠素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)和POD活性的結(jié)果為3個樣每樣3次重復(fù)的平均值，其他指標(biāo)的結(jié)果為30株苗(10株/重復(fù)×3次重復(fù))的平均值。用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0進行處理間的差異顯著性分析，Duncan法進行多重比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉的分離純化

孟加拉紅培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)3 d時，白色菌絲形成疑似木霉的菌落(圖1Aa、圖1Ab)。挑取菌絲到PDA斜面，28 ℃培養(yǎng)2 d，獲得純化的Lj菌株(圖1Bc)。培養(yǎng)7 d，產(chǎn)生大量綠色分生孢子(圖1Bd)。

A.孟加拉紅培養(yǎng)基；B.PDA培養(yǎng)基；a.培養(yǎng)3 d(正面)；b.培養(yǎng)3 d(背面)；c.培養(yǎng)2 d；d.培養(yǎng)7 d。

2.2 木霉Lj菌株的形態(tài)

28 ℃ PDA平板培養(yǎng)3 d，菌落直徑約為90 mm，菌絲白色、叢毛狀。產(chǎn)孢簇外觀絨狀，培養(yǎng)3 d產(chǎn)孢區(qū)為黃綠色(圖2a)，培養(yǎng)7 d為暗黑綠色(圖2b)。菌絲寬度為1～9 μm，分枝多呈銳角，少數(shù)近直角(圖2c)。分生孢子梗直徑6～9 μm，常有2～3次分枝，近基部的分枝一般成對，而近頂部的分枝一般單生或?qū)ι７稚咦悠抗０碴承?，具?xì)而短的頸部，排列成輪枝狀或排列不規(guī)則。分生孢子橢圓形，長3～4 μm，寬1.5～2.5 μm，壁薄而光滑，單個時淺灰色，聚集時灰綠色(圖2d、圖2e)。其形態(tài)基本與毛簇木霉(T.velutinum)[17]236-238一致。

a、b.純化后Lj菌株(3 d和7 d)；c.菌絲(2 d)；d、e.分生孢子及分生孢子梗(7 d)。

2.3 木霉Lj菌株的ITS鑒定

以菌株Lj菌絲體基因組DNA(圖3a)為模板，PCR擴增其ITS序列，序列大小為500～750 bp(圖3b)。將該PCR產(chǎn)物切膠純化(圖3c)后進行TA克隆，轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR驗證，確認(rèn)陽性克隆(圖3d)，測序得到ITS基因序列，長度約620 bp。該序列的GenBank接受號為MG386272。經(jīng)TrichOKEY和TrichoBLAST分析ITS序列，Lj被鑒定為毛簇木霉。

a.菌絲體基因組DNA；b.ITS序列的PCR擴增產(chǎn)物；c.純化后的ITS序列；d.ITS序列TA克隆的PCR驗證(M為DL 2000 marker)。

2.4 木霉Lj菌株對植物病原真菌的拮抗效果

木霉菌株Lj對供試的3種植物病原真菌菌絲生長有顯著的抑制效果(圖4)。對峙培養(yǎng)5 d后，與對照1相比，木霉菌株Lj對A.alternata、F.oxysporum和C.chrysosperma抑制率為(44.56±1.79)%、(37.51±3.03)%和(60.90±1.07)%，與對照2相比，抑制率分別為(38.39±1.91)%、(28.40±3.05)%、(52.63±1.43)%。抑菌率為6次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

A.A.alternata；B.F.oxysporum；C.C.chrysosperma；a、d、g.對照1；b、e、h.對照2；c、f、i.Lj與植物病原真菌的對峙。

圖4木霉Lj菌株對植物病原真菌的拮抗效果

2.5 木霉Lj菌株對小白菜的促生作用

植物葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與植物的光合作用、營養(yǎng)狀況密切相關(guān)，是反映植物生長狀況的重要指標(biāo)。而POD廣泛存在于植物細(xì)胞中，能夠消除過氧化氫和酚類、胺類對植物的毒性[18]。

由圖5、6可見，各時段木霉處理組小白菜的生長狀態(tài)均好于對照組。由表1可見，處理組小白菜的葉長、根長和鮮質(zhì)量在播種后15 d和30 d均明顯大于對照組。相應(yīng)地，處理組小白菜的葉綠素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯高于對照，各時段均表現(xiàn)為隨Lj孢子濃度下降而增加，并在106個·mL-1組最高(表2)。葉POD活性在15 d時與對照無顯著差異，30 d和45 d時大部分處理組顯著高于對照，分別在109和106個·mL-1組最高(表2)?？梢?，木霉對小白菜有前期促生長和后期提高POD活性的作用。

A.處理15 d；B.處理30 d；C.處理45 d；a、f、k.對照；b、g、l.孢子濃度為1×109個·mL-1；c、h、m.孢子濃度為1×108個·mL-1；d、i、n.孢子濃度為1×107個·mL-1；e、j、o.孢子濃度為1×106個·mL-1。

圖5木霉Lj菌株處理后小白菜的總體生長狀況

3 結(jié)論與討論

有些廣泛存在且重要的木霉至今未發(fā)現(xiàn)有性型[19]，而已知有性型的木霉種也很難人工培養(yǎng)獲得有性階段子實體，所以目前最常用的Gams & Bissett木霉分類系統(tǒng)仍以無性階段特征為分類依據(jù)[20]。但木霉無性型在形態(tài)學(xué)上存在漸變現(xiàn)象[17]26，實際應(yīng)用中按形態(tài)特征分類不好把握，所以木霉分類常用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法。ITS序列分析是木霉分類鑒定中較常用的簡便快速而且準(zhǔn)確的方法[17]57-59。經(jīng)形態(tài)鑒定和ITS序列分析，菌株Lj被一致鑒定為毛簇木霉(T.velutinum)。

A.處理15 d；B.處理30 d；C.處理45 d；a-c.對照；d-f.孢子濃度為1×109個·mL-1；g-i.孢子濃度為1×108個·mL-1；j-l.孢子濃度為1×107個·mL-1；m-o.孢子濃度為1×106個·mL-1。

圖6 木霉Lj菌株處理后小白菜的個體生長狀況

注：表中數(shù)據(jù)為30株苗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

表2 木霉Lj菌株處理對小白菜葉綠素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)及POD活性的影響

注：表中的數(shù)據(jù)為3個樣每樣3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

毛簇木霉已在我國廣東、四川、山東、河南等省份的土壤中分離到[21-22]。該種在印度也被發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為是嗜冷真菌[23]，能產(chǎn)生非核糖體肽和細(xì)胞壁降解酶，可作為生防制劑[24]。對峙培養(yǎng)時毛簇木霉對煙草疫霉菌(Phytophthoraparasiticavar．nicotianae)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、楊葉枯病菌(A.alternata)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsici)、棉花黃萎病菌(Verticilliumdahliae)有拮抗作用[22,24]。與前人研究結(jié)果相似的是，本研究也發(fā)現(xiàn)毛簇木霉Lj對尖孢鐮刀菌、楊葉枯病菌和楊樹爛皮病菌(C.chrysosperma)具較強拮抗作用。而且，3種植物病原菌中，對楊樹爛皮病菌的拮抗作用最強，抑菌率可達(dá)60.9%。認(rèn)為毛簇木霉Lj菌株可開發(fā)為生防制劑。

Zachow et al.發(fā)現(xiàn)毛簇木霉能在甜菜根表面和根內(nèi)定植，同時處理組甜菜葉長顯著大于對照組[25]。本研究發(fā)現(xiàn)毛簇木霉菌肥施用于小白菜后，30 d內(nèi)處理組植株根長、葉長和鮮質(zhì)量明顯高于對照組，相應(yīng)的小白菜葉綠素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著較高，施肥最適濃度為106個·mL-1?？梢姡啬久筁j菌肥一次施用對小白菜生長的促進作用至少可持續(xù)30 d。預(yù)期該菌肥在設(shè)施小白菜的增產(chǎn)方面具有一定應(yīng)用價值。

已報道木霉促植物生長主要途徑為代謝產(chǎn)物的促生作用，與促生根際微生物的有益互作，以及促進土壤中營養(yǎng)物質(zhì)釋放等方面[25-26]。而毛簇木霉菌株Lj對小白菜的促生作用機理有待進一步研究。

木霉促植物生長的過程往往伴隨著植物防御酶活性的增加和植物抗逆能力的提升。植物過氧化物酶(POD)是重要的解毒酶之一，可降低逆境對植物生長的影響，其活性與植物抗逆能力密切相關(guān)[18]。本研究中，小白菜葉片POD活性在30 d和45 d時大部分處理顯著高于對照，分別在109、106個·mL-1組最高。毛簇木霉菌肥的處理可能有助于提高生長后期小白菜植株的抗逆能力。由于植物光合作用、次生代謝產(chǎn)物合成、脅迫條件的變化均可能影響抗氧化酶活性，使之產(chǎn)生非線性的變化[27]，本研究中取樣點較少，時間間隔較長，可能無法找到POD變化的拐點，不能精確反映其變化規(guī)律。