賈文聰， 伊明·尕哈甫， 古麗格娜·吐爾地， 陳丹溪， 李玉玲， 王晨琪， 古麗巴哈爾·卡吾力

(1新疆醫(yī)科大學藥學院藥學2014-2班； 2新疆醫(yī)科大學藥學院， 烏魯木齊 830011)

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)為茄科枸杞屬多棘刺灌木，主要分布于我國的寧夏、青海、新疆等西部地區(qū)[1-2]。黑果枸杞是我國傳統(tǒng)的藥食兼用的名貴藥材，主要化學成分有蛋白質(zhì)、脂肪、多糖、黃酮、原花青素、微量元素以及氨基酸等，長期服用具有保護視力、防治糖尿病、保肝、抗腫瘤、降壓，保護心血管系統(tǒng)等作用[3-4]。黑果枸杞多糖(LyciumruthenicumMurr. polysaccharides，LBP)是其中的主要有效成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗疲勞、抗氧化以及降血糖、降血脂等功效，臨床多用于治療胃癌、肝癌[5-14]。目前，黑果枸杞多糖的提取方法主要有水浸提取法、酸堿法、超聲波提取法、微波法、酶法等。本研究分別采用單因素和正交試驗設計，通過超聲波提取黑果枸杞多糖，采用Saveg法和過氧化氫法，探究黑果枸杞多糖的提取、脫蛋白、脫色的最佳工藝，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料與試劑牛血清白蛋白(純度≥98%，南京奧多富尼生物科技有限公司，批號20170510)，葡萄糖標準品(純度≥98%，純優(yōu)生物制品有限公司，批號20170314)，木瓜蛋白酶(活力單位≥600 U/g，壇墨質(zhì)檢科技有限公司，批號20170112)，苯酚(濟南鈞源化工有限公司，批號20161203)，濃硫酸(天地奧化工有限公司，批號20170320)，無水乙醇(濟南鈞源化工有限公司，批號20170403)，石油醚(西安義信化工有限公司，批號20161124，沸程60-90℃)；乙醚(西安義信化工有限公司，批號20161025)，95%乙醇(濟南鈞源化工有限公司，批號20170104)，丙酮(濟南鈞源化工有限公司，批號20170316)，試劑均為分析純。

1.2儀器UV-9100型紫外可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司)，XL-02A型扣壓式小型粉碎機(旭朗機械有限公司)，HWS24型電熱恒溫水浴鍋(上海恒科學儀器有限公司)，SHZ型循環(huán)真空泵(鄭州博科儀器設備有限公司)，XPE型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，DP-D65UE型多用途恒溫超聲波提取機 (無錫德譜儀器制造有限公司)。

1.3藥材黑果枸杞2016年4月采自于新疆維吾爾自治區(qū)阿克蘇市，經(jīng)過新疆醫(yī)科大學藥學院生藥/天藥教研室帕麗達教授鑒定為茄科枸杞屬植物黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)的干燥果實。

1.4方法

1.4.1 多糖的提取方法 將采集的黑果枸杞清洗后在陰涼處干燥至恒重，用粉碎機粉碎并過40目篩，采用索氏提取器用石油醚提取6.0 h脫脂后，加入500 mL蒸餾水于80℃水浴攪拌加熱2 h，過濾，濾渣重復提取1次，合并2次濾液，3 000 r/min離心15 min，將提取液減壓濃縮至200 mL，加入無水乙醇使乙醇濃度達到80%，于4℃醇沉12 h后，離心分離，收集沉淀，依次用95%乙醇，無水乙醇、乙醚、丙酮洗滌2次，真空干燥至恒重，即得黑枸杞多糖。

1.4.2 多糖含量測定方法學考察

1.4.2.1 標準曲線的繪制 稱取葡萄糖標準品50 mg置于500 mL 容量瓶中定容，分別吸取 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL 葡萄糖標準品溶液，用蒸餾水補足至2.0 mL，加入1.0 mL 6%的苯酚后混勻，迅速加入 5.0 mL 濃硫酸，靜置 5 min 后混勻，水浴加熱 5 min，冷卻至室溫，測定490 nm 處吸光度，以 2.0 mL 蒸餾水作為空白對照。以吸光度值為縱坐標(X)，葡萄糖含量(Y)為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程：Y=0.013 8X+0.023 4，R2=0.999 1。

1.4.2.2 精密度試驗 吸取0.02、0.04、0.06 mg/mL 3種濃度葡萄糖標準溶液1.0 mL，按“1.4.2.1”項下方法連續(xù)測定5次，RSD分別為1.3%、1.5%、1.8%,表明試驗度良好。

1.4.2.3 穩(wěn)定性試驗 吸取0.02、0.04、0.06 mg/mL 3種濃度葡萄糖標準溶液1.0 mL，按“1.4.2.1”項下方法分別在0、2、4、6、8、10 h測定，RSD分別為2.1%、1.3%、1.5%,表明試驗穩(wěn)定性良好。

1.4.2.4 加樣回收率考察 吸取9份已知多糖濃度的供試品1.0 mL，分別加入0.02、0.04、0.06 mg/mL 3種濃度的葡萄糖標準品溶液1.0 mL，按“1.4.2.1”項下方法測定，平均回收率分別為99.73%、98.01%、99.12%。

1.4.3 超聲波提取黑果枸杞多糖 稱取5份脫脂處理后的黑果枸杞各1.0 g，設置料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)、超聲時間(15、30、45、60、75 min)、超聲功率(40、50、60、70、80 W)，在90℃進行超聲波提取，提取液醇沉洗滌，離心、冷凍干燥，按“1.4.2.1”項下方法測定，按公式：多糖提取率/%=X1/X2×100%[式中：X1為黑果枸杞多糖質(zhì)量(μg)；X2為黑果枸杞藥材質(zhì)量(μg)]計算多糖提取率。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇9(34)正交試驗設計進一步優(yōu)化提取方法，見表1。

表1 多糖提取正交試驗因素水平表

1.4.4 黑果枸杞多糖Saveg法脫蛋白工藝

1.4.4.1 蛋白標含量測定 稱取牛血清白蛋白20 mg，置50 mL容量瓶中，加水溶解后稀釋至刻度制成貯備液。分別吸取貯備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，加水稀釋至l0 mL，向各管中加入5 mL考馬斯亮藍G250，以蒸餾水為空白，在465 nm處測定蛋白質(zhì)含量，以吸光度值為縱坐標，蛋白質(zhì)含量為橫坐標繪制標準曲線，用最小二乘法擬合校準曲線方程為Y=0.014 8X+0.330 1，R2=0.999 2。

1.4.4.2 黑果枸杞多糖脫蛋白工藝 稱取5份黑果枸杞粗多糖10 mg置10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度。吸取粗多糖溶液2.0 mL，固定Saveg試劑中氯仿∶正丁醇=1∶4比例，設置Saveg試劑與粗多糖溶液比例(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)、處理時間(60、70、80、90、100 min)、處理溫度(55、65、75、85、95℃)進行震蕩脫蛋白處理，3 000 r/min離心15 min，棄去沉淀，上清液按照“1.4.2.1”項下方法測定多糖和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，按公式：多糖保留率/%=X1/X2×100%[式中：X1為黑果枸杞多糖脫蛋白后多糖質(zhì)量濃度(μg/mL)；X2為黑果枸杞多糖脫蛋白前多糖質(zhì)量濃度(μg/mL)]，計算其多糖保留率,按公式：蛋白脫除率/%=C1/C2×100%[式中：C1為黑果枸杞多糖脫蛋白前粗多糖中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(μg/mL)；C2為黑果枸杞多糖脫蛋白后粗多糖中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(μg/mL)]， 計算其蛋白脫除率。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇L9(34)正交試驗設以綜合評分法給予多糖保留率和脫蛋白率各50%權重計算綜合得分進一步優(yōu)化脫蛋白方法，見表2。

1.4.5 黑果枸杞多糖過氧化氫脫色工藝 稱取5份黑果枸杞粗多糖10 mg置10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，配制成粗多糖溶液。吸取粗多糖溶液2.0 mL，設置過氧化氫加入量(0.50、0.75、1.00、1.25、1.50%)、處理時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)、處理溫度(35、45、55、65、75℃)進行處理，離心，棄去沉淀，上清液按照含量測定方法測定多糖質(zhì)量濃度，按公式：脫色率/%=C1/C2×100%[式中：C1為黑果枸杞多糖脫色前粗多糖質(zhì)量濃度(μg/mL)；C2為黑果枸杞多糖脫色后粗多糖質(zhì)量濃度(μg/mL)]，計算脫色率。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇L9(34)正交試驗設計以多糖脫色率為考察指標選擇黑果枸杞多糖脫色工藝參數(shù)，見表3。

表2 Saveg法脫蛋白正交試驗因素水平表

表3 過氧化氫法脫色正交試驗因素水平表

1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1超聲波提取黑果枸杞多糖試驗結(jié)果

2.1.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1.1 料液比對黑果枸杞多糖提取率的影響 按“1.4.3”項下方法測得多糖提取率，分別考察料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50時黑果枸杞多糖提取率的變化，當料液比為1∶10時，多糖提取率為5.80%，達到最高，故選擇1∶10為料液比，見圖1。

圖1 料液比對黑果枸杞多糖提取率的影響

2.1.1.2 超聲時間對黑果枸杞多糖提取率的影響 按“1.4.3”項下方法測得多糖提取率，分別考察超聲時間為15、30、45、60、75 min時黑果枸杞多糖提取率的變化，當超聲時間為30 min時，多糖提取率為5.59%，達到最高，故選擇30 min為超聲時間，見圖2。

圖2 超聲時間對黑果枸杞多糖提取率的影響

2.1.1.3 超聲功率對黑果枸杞多糖提取率的影響 按“1.4.3”項下方法測得多糖提取率，分別考察超聲功率為40、50、60、70、80 W時黑果枸杞多糖提取率的變化，當超聲功率為60 W時，多糖提取率為5.51%，達到最高，故選擇60 W為超聲功率,見圖3。

圖3 超聲功率對黑果枸杞多糖提取率的影響

2.1.2 正交試驗結(jié)果 根據(jù)單因素試驗分析結(jié)果，正交試驗選擇料液比(1∶10、1∶20、1∶30)、超聲時間(15、30、45 min)、超聲功率(50、60、70 W)3個因素進行分析，結(jié)果表明超聲時間和超聲功率影響最大，各因素對多糖提取率影響主次序為C>B>A，超聲提取黑果枸杞多糖的最佳工藝組合為A3B2C1，即料液比為1∶10、超聲時間為30 min、超聲功率為70 W。按照此條件進行測定，黑果枸杞多糖的提取率為7.01%，見表4、5。

表4 超聲波提取多糖正交試驗結(jié)果

表5 方差分析結(jié)果

2.2黑果枸杞多糖脫蛋白工藝結(jié)果

2.2.1 單因素實驗結(jié)果

2.2.1.1 Saveg試劑與粗多糖比例對黑果枸杞多糖脫蛋白率的影響 按“1.4.4.2”項下方法測得多糖保留率和蛋白脫除率，分別考察Saveg試劑與粗多糖比例為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5時黑果枸杞多糖保留率和蛋白脫除率的變化，當Saveg試劑與粗多糖比例為1∶3時，多糖保留率(53.05%)和蛋白脫除率(51.32%)達到最高，故選擇1∶3為Saveg試劑與粗多糖比例，見圖4。

2.2.1.2 處理時間對黑果枸杞多糖脫蛋白率的影響 按“1.4.4.2”項下方法測得多糖保留率和蛋白脫除率，分別考察處理時間為60、70、80、90、100 min時黑果枸杞多糖保留率和蛋白脫除率的變化，當處理時間為80 min'時，多糖保留率(77.11%)和蛋白脫除率(69.08%)達到最高，故選擇80 min為處理時間，見圖5。

圖4 Saveg試劑與粗多糖比例對黑果枸杞多糖脫蛋白率的影響

圖5 處理時間對黑果枸杞多糖脫蛋白率的影響

2.2.1.3 處理溫度對黑果枸杞多糖脫蛋白率的影響 按“1.4.4.2”項下方法測得多糖保留率和蛋白脫除率，分別考察處理溫度為55、65、75、85、95℃時黑果枸杞多糖保留率和蛋白脫除率的變化，當處理溫度為75℃時，多糖保留率(46.89%)和蛋白脫除率(77.26%)達到最高，故選擇75℃為處理時間，見圖6。

圖6 處理溫度對黑果枸杞多糖脫蛋白率的影響

2.2.2 正交試驗結(jié)果 根據(jù)單因素試驗分析結(jié)果，正交試驗選擇Saveg試劑加入量(1∶2、1∶3、1∶4)、處理時間(60、70、80 min)、處理溫度(75、85、95℃)3個因素進行分析，3個因素影響差異都具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，各因素對多糖脫蛋白率影響主次序為A >C>B，黑果枸杞多糖脫蛋白率工藝最佳組合為A1B1C3，即Saveg試劑與粗多糖比例為1∶2，處理時間為60 min、處理溫度為95℃。在此結(jié)果上，進一步進行驗證試驗，多糖脫蛋白率為75.46%，為黑果枸杞多糖脫蛋白方法最佳條件，見表6、7。

表6 多糖脫蛋白率正交試驗結(jié)果

表7 方差分析結(jié)果

2.3黑果枸杞多糖脫色工藝結(jié)果

2.3.1 單因素試驗

2.3.1.1 過氧化氫加入量對黑果枸杞多糖脫色率的影響 按“1.4.5”項下方法測得多糖脫色率，分別考察過氧化氫加入量為0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%時黑果枸杞多糖脫色率的變化，當過氧化氫加入量為0.75%時，多糖脫色率(44.54%)達到最高，故選擇0.75%為過氧化氫加入量，見圖7。

圖7 過氧化氫的加入量對黑果枸杞多糖脫色率的影響

2.3.1.2 處理時間對黑果枸杞多糖脫色率的影響 按“1.4.5”項下方法測得多糖脫色率，分別考察處理時間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h時黑果枸杞多糖脫色率的變化，當處理時間為2 h時，多糖脫色率(45.97%)達到最高，故選擇2 h為處理時間，見圖8。

圖8 處理時間對黑果枸杞多糖脫色率的影響

2.3.1.3 處理溫度對黑果枸杞多糖脫色率的影響 按“1.4.5”項下方法測得多糖脫色率，分別考察處理溫度為35、45、55、65、75 ℃時黑果枸杞多糖脫色率的變化，當處理溫度為55 ℃時，多糖脫色率(53.58%)達到最高，故選擇55 ℃為處理溫度，見圖9。

圖9 處理溫度對黑果枸杞多糖脫色率的影響

2.3.2 正交試驗結(jié)果 根據(jù)單因素試驗分析結(jié)果，正交試驗選擇過氧化氫加入量(0.75、1.00、1.25%)、處理時間(1.0、1.5、2.0 h)、處理溫度(35、45、55℃)3個因素進行分析，3個因素的影響差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，各因素對多糖脫色率影響主次序為B>C>A，黑果枸杞多糖脫色率工藝最佳組合為A2B3C2，即過氧化氫加入量為1.0%，處理時間為2.0 h、處理溫度為45℃。在此結(jié)果上，進一步進行驗證試驗，多糖脫色率為62.34%，為黑果枸杞多糖脫色方法最佳條件，見表8、9。

表8 多糖脫色率正交試驗結(jié)果

表9 方差分析結(jié)果

3 討論

黑果枸杞是藥食兩用的珍貴藥材，它生長在人類無法生存的荒山野嶺、河床沙灘，擁有著極強的生命力。但隨著人類對大自然的開發(fā)，黑果枸杞的生存空間愈來愈少，造就了黑果枸杞這一珍稀珍貴的原生態(tài)高檔滋補佳品。研究表明黑枸杞含蛋白質(zhì)、枸杞多糖、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、微量元素等多種營養(yǎng)成分，比一般紅枸杞更珍貴更有藥用價值，用于治療心熱病、心臟病、降低膽固醇、興奮大腦神經(jīng)、增強免疫功能、防治癌癥、抗衰老、美容養(yǎng)顏、月經(jīng)不調(diào)、停經(jīng)等且藥效顯著[15-20]。

本研究以多糖提取率為評價指標，通過單因素和正交試驗設計，分別超聲波方法提取多糖，確定黑果枸杞多糖提取條件。結(jié)果顯示超聲波提取多糖時，料液比為1∶10、超聲時間為30 min、超聲功率為70W時多糖提取率就可以達到7.01%。以蛋白脫除率和多糖保留率為考察指標對黑果枸杞多糖進行脫蛋白，當Saveg試劑與粗多糖比例為1∶2，處理時間為60 min、處理溫度為95℃。在此結(jié)果上，進一步進行驗證試驗，多糖脫蛋白率為75.46%。以脫色率為評價指標對黑果枸杞多糖進行脫色，當過氧化氫加入量為1.0%，處理時間為2.0 h、處理溫度為45 ℃時多糖脫色率為62.34%。通過上述試驗對黑果枸杞多糖進行提取、脫蛋白和脫色，得到淡黃色多糖粉末，其工藝結(jié)果穩(wěn)定、可靠、影響因素較少，初步確定為黑果枸杞多糖提取、脫蛋白和脫色工藝，為黑果枸杞后續(xù)研究提供理論依據(jù)和試驗基礎。