李光遠(yuǎn) ，婁建石 ，陳 斌 ，李 楠 ，王曉輝 ，劉佩莉 ，祝君梅

（1.天津醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)系，天津300070；2.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所醫(yī)用生物材料監(jiān)測研究中心，天津300020）

醋甲唑胺（methazolamide，MTZ）是一種新型的碳酸酐酶抑制劑[1]，通過抑制睫狀體中的碳酸酐酶，使房水生成減少，降低眼內(nèi)壓。其作為眼科治療開角型青光眼、繼發(fā)性青光眼的常用藥物，在臨床上得到廣泛應(yīng)用[2-3]。本實(shí)驗(yàn)采用乳化-蒸發(fā)-交聯(lián)法，以巰基化羧甲基殼聚糖（thiolatedcarboxymethyl chitosan,tCMCS）為載體[4-5]，包裹 MTZ 形成納米球（thiolatedcarboxymethyl chitosan-carried methazolamide nanoparticles，tCMCS-MTZ-Ns），將其制備成滴眼劑（thiolatedcarboxymethyl chitosan-carried methazolamide nanoparticles eye drop，tCMCS-MTZ-NED)[6]。對該滴眼劑進(jìn)行眼刺激試驗(yàn)、遲發(fā)超敏試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)（MTT法和LDH法），為該滴眼劑的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑醋甲唑胺原料藥（武漢大華偉業(yè)醫(yī)藥化工有限公司。批號：20160912，純度為99.2%），羧甲基殼聚糖（CMC，浙江澳興生物科技有限公司，分子量30萬，羧化度80%），三聚磷酸鈉（TPP，分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)，甲醛（天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司，分析純，150215），生理鹽水（中國大冢制藥有限公司，5K72G2），2,4-二硝基氯苯（天津光復(fù)精細(xì)化工研究所，化學(xué)純，批號：2015年7月11日），弗氏完全佐劑（Sigma，批號：SLBF9338V），二甲基亞砜（天津瑞金特化學(xué)品有限公司，批號：2014/05），四唑鹽（MTT，BIOSHARP），1640 培養(yǎng)液（HyClone，批號：NZL1265），胰酶細(xì)胞消化液（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：312ML0110），乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒（貨號：A020-2，微量酶標(biāo)法），聚山梨酯-80（Tween-80，分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司），乙酸乙酯（分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司），乙醇（分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司），乙醚（分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）。

細(xì)胞株：NCTCclone929（小鼠成纖維細(xì)胞L-929，來源：中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 日本大耳白兔，雄性，2.0～2.5 kg（北京隆安實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖中心，許可證編號：SCXK（京）2014-0003）實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。白化豚鼠，雄性，300～400 g（北京隆安實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖中心，許可證編號：SCXK（京）2014-0003），實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)3d。

1.1.3 儀器 酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃公司，MK3），CO2培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技公司，HERAcell 150i），全溫振蕩培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，HZP-150），LYL-Ⅱ裂隙燈顯微鏡（鳳凰光學(xué)儀器集團(tuán)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 tCMCS-MTZ-NED制備 將MTZ原料藥溶于乙酸乙酯，加入混合乳化劑(Tween-80和無水乙醇)，在常溫下超聲，滴入0.5%HCl，繼續(xù)超聲，滴入tCMC溶液，待乳液變清時(shí)，再滴入TPP溶液，繼續(xù)超聲，即得到載藥納米球混懸液。6 000 r/min離心20 min，所得沉淀用乙醚沖洗，-80℃低溫冰箱中保存，經(jīng)冷凍干燥機(jī)制成凍干品。

1.2.2 浸提液制備

1.2.2.1 遲發(fā)超敏試驗(yàn)浸提液制備：tCMCS-MTZNED按照0.2 g/mL的比例使用生理鹽水和芝麻油在37℃下浸提72 h。

1.2.2.2 細(xì)胞毒性試驗(yàn)浸提液制備：tCMCS-MTZNED按照0.2 g/mL的比例使用含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃下浸提72 h。

1.2.3 遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn) 選用體質(zhì)量300～400 g皮膚完好的健康白化豚鼠50只，將50只豚鼠按體重分層隨機(jī)分為5組，樣品生理鹽水浸提液組10只，芝麻油浸提液組10只，陰性對照生理鹽水和芝麻油浸提介質(zhì)組各10只，陽性對照組0.5%2，4-二硝基氯苯10只。試驗(yàn)前24h剪剃背部區(qū)域被毛。

皮內(nèi)誘導(dǎo)：試驗(yàn)時(shí)用75%酒精消毒試驗(yàn)區(qū)域后在脊柱兩側(cè)從頭向尾成對的進(jìn)行3對(6個(gè)點(diǎn))皮內(nèi)注射，每點(diǎn)注射0.1 mL。第一對A液，為弗氏完全佐劑與生理鹽水或芝麻油等體積混合。第二對B液，為試驗(yàn)樣品浸提液，對照組為陰性或陽性對照液。第三對C液，為A液與B液等體積混合。

局部誘導(dǎo)：皮內(nèi)注射后6 d，各注射部位用10%十二烷基硫酸鈉按摩導(dǎo)入，24 h后按組貼敷于B液中浸泡至飽和的濾紙片，固定并留置48 h。

激發(fā)：局部誘導(dǎo)后13 d，剪去豚鼠腹部毛發(fā)，用75%酒精消毒試驗(yàn)區(qū)域后，按組貼敷于C液中浸泡至飽和的濾紙片，固定并留置24 h。

除去敷貼物后24 h和48 h，觀察貼敷區(qū)皮膚的紅斑、水腫等反應(yīng)，按Magnusson和Kligman分級標(biāo)準(zhǔn)（表1）對每一激發(fā)部位和每一觀察時(shí)間皮膚紅斑和水腫反應(yīng)進(jìn)行描述并分級。記錄觀察時(shí)間和激發(fā)部位紅斑和水腫反應(yīng)分級。

表1 Magnusson和Kligman分級Tab 1 Grading of Magnusson and Kligman

1.2.4 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)

1.2.4.1 MTT法：在96孔培養(yǎng)板上接種L-929細(xì)胞，接種密度為1×104/mL的細(xì)胞懸液，每孔100 μL，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)液?？瞻捉M（BL）用細(xì)胞培養(yǎng)液交換，陰性對照組用浸提比例為0.2 g/mL高密度聚乙烯浸提液（PE）交換，陽性對照組用含5%二甲基亞砜（DMSO）的細(xì)胞培養(yǎng)液交換，試驗(yàn)樣品組用載銀納米粒凝膠劑浸提液或納米銀浸提液進(jìn)行交換。置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)72 h。更換培養(yǎng)液后 72 h，每孔加入 20 μL、5 g/L 四唑鹽(MTT)溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去孔內(nèi)液體，加入150 μL二甲基亞砜，置振蕩器上振蕩10 min，在酶標(biāo)儀570 nm和630 nm處測定各孔吸光度。計(jì)算相對增殖率（RGR）。細(xì)胞毒性反應(yīng)分級見表2。

表2 細(xì)胞毒性反應(yīng)分級Tab 2 Cytotoxic reaction grading

計(jì)算公式為RGR（%）=（570 nm材料組平均值-630 nm材料組平均值/570 nm陰性對照組平均值-630 nm陰性對照組平均值）×100%。

1.2.4.2 LDH法：在96孔培養(yǎng)板上接種L-929細(xì)胞,接種密度為1×104/mL的細(xì)胞懸液，每孔100 μL，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)液?？瞻捉M用細(xì)胞培養(yǎng)液交換，陰性對照組用浸提比例為0.2 g/mL高密度聚乙烯浸提液交換，陽性對照組用含1%Triton-X-100的細(xì)胞培養(yǎng)液交換，試驗(yàn)樣品組用浸提液進(jìn)行交換。置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)72 h。更換培養(yǎng)液后72 h，每孔按照說明依次加入試劑盒中試劑，混勻，室溫靜置5 min，450 nm波長處酶標(biāo)儀測定吸光度值。計(jì)算LDH總釋放率（T）。結(jié)果見表5。

計(jì)算公式為T（%）=（試驗(yàn)樣品組的平均吸光度值-溶劑對照組的平均吸光度值）/（Triton-X-100對照組的平均吸光度值-溶劑對照組的平均吸光度值）

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算MTT試驗(yàn)中tCMCS-MTZ-NED的半數(shù)生長抑制濃度(IC50)和LDH試驗(yàn)中LDH釋放率達(dá)到50%時(shí)tCMCS-MTZ-NED的濃度。

2 結(jié)果

2.1 遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn) 見表3。試驗(yàn)結(jié)果表明，受試組和陰性對照組在去除貼敷24 h和48 h后未見紅斑、水腫，陽性對照出現(xiàn)不同程度紅斑反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)材料對豚鼠不致敏。

表3 tCMCS-MTZ-NED對豚鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果(n=10)Tab 3 Results of delayed type hypersensitivity of tCMCS-MTZNED in guinea pigs (n=10)

2.2 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)

2.2.1 MTT試驗(yàn)結(jié)果 見表4。試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)樣品的浸提液細(xì)胞毒性反應(yīng)為2級。

2.2.2 LDH試驗(yàn)結(jié)果 見表5。試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)樣品浸提比例為0.2 g/mL時(shí)，LDH釋放率為37.09%。

表4 tCMCS-MTZ-NED MTT試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 MTT test results for tCMCS-MTZ-NED

表5 tCMCS-MTZ-NED LDH試驗(yàn)結(jié)果Tab 5 LDH test results for tCMCS-MTZ-NED

2.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)果采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算得出MTT試驗(yàn)中tCMCS-MTZ-NED的半數(shù)生長抑制濃度（IC50）為0.24 g/mL，LDH試驗(yàn)中LDH釋放率達(dá)到50%時(shí)tCMCS-MTZ-NED的濃度為0.54 g/mL。

3 討論

醋甲唑胺是一種碳酸酐酶抑制劑，碳酸酐酶（CA）是一種含鋅金屬酶，它在睫狀上皮細(xì)胞中催化CO2和H2O最終生成CO32-，透過腔膜分泌于房水。由于溶液要保持電中性，Na+向房水分泌增加，同時(shí)帶動Cl-向房水遷移，從而在房水形成高滲透壓，促進(jìn)H2O向房水方向運(yùn)動，保持房水的離子平衡及其流量[7-8]，而青光眼患者由于房水回流不暢引起眼內(nèi)壓升高。碳酸酐酶抑制劑可抑制CA的活性，使HCO3-的生成減少，從而減少 HCO3-、Na+、Cl-和 H2O進(jìn)入房水，使房水生成減少，起到降低眼內(nèi)壓作用，臨床上用于治療青光眼[9-10]。Calvo[11]等研究發(fā)現(xiàn)，納米球給藥系統(tǒng)使角膜滲透性提高了4～5倍。徐詠梅[12]等研究發(fā)現(xiàn)巰基化羧甲基殼聚糖生物黏附性更高。本實(shí)驗(yàn)首次使用巰基化改性的羧甲基殼聚糖衍生物用于局部眼科給藥的載體材料，除改善親水性，還可與角膜外黏液層中的糖蛋白黏附，使納米球能更好地集聚在角膜表面，緩釋的MTZ不斷通過角膜屏障進(jìn)入房水并維持有效濃度，達(dá)到提高M(jìn)TZ生物利用度的目的。

在此之前，已對本實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行了眼刺激試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明動物雙眼對光反射良好，角膜區(qū)透明，虹膜、結(jié)膜正常，均未見充血，眼瞼無水腫，無分泌物生成[13]。本研究依據(jù)GB/T16886《醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)》的評價(jià)方法[14]，對產(chǎn)品進(jìn)行了遲發(fā)超敏試驗(yàn)和體外細(xì)胞毒試驗(yàn)，遲發(fā)超敏試驗(yàn)結(jié)果表明本材料對豚鼠皮膚無致敏性，在體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)中，試驗(yàn)樣品濃度為0.2 g/mL和0.1 g/mL的浸提液細(xì)胞毒性反應(yīng)為2級，其原因可能是由于納米球可以透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或進(jìn)入細(xì)胞器，并和生物大分子發(fā)生反應(yīng)，使生物膜發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性。本試驗(yàn)通過兩種方法測定了給藥系統(tǒng)的細(xì)胞毒性。MTT試驗(yàn)主要檢測細(xì)胞線粒體功能障礙，即琥珀酸脫氫酶活性的抑制，從而考察細(xì)胞活性和生長狀態(tài);而LDH試驗(yàn)是檢測受試物對細(xì)胞膜的破壞。試驗(yàn)結(jié)果提示實(shí)驗(yàn)材料引起細(xì)胞毒性的機(jī)理主要是通過影響細(xì)胞器的功能，但LDH試驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)材料也引起了一定程度細(xì)胞膜的破壞，為毒性機(jī)制的分析提供依據(jù)。IC50是細(xì)胞半數(shù)致死時(shí)所需要的藥物濃度，該指標(biāo)能夠定量地反映tCMCS-MTZ-NED濃度對細(xì)胞毒性的影響，為tCMCS-MTZ-NED的生物安全性評價(jià)提供更加全面的數(shù)據(jù)支持。