周 民 ，魏 源，陳海燕，喻文強，侯 紅，吳豐昌，譚偉強

1.青島理工大學(xué) 環(huán)境與市政工程學(xué)院，青島266033

2.中國環(huán)境科學(xué)研究院 環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險評估國家重點實驗室，北京100012

3.南昌大學(xué) 資源環(huán)境與化工學(xué)院，南昌330031

復(fù)合重金屬污染是指兩種或兩種以上重金屬元素同時作用所形成的環(huán)境污染現(xiàn)象（何勇田和熊先哲，1994）。近年來，隨著伴生礦的開采量逐年增加以及大量含重金屬的農(nóng)藥的使用，造成土壤復(fù)合重金屬污染狀況日益嚴(yán)重，由此引起土壤肥力嚴(yán)重降低、農(nóng)作物重金屬含量超標(biāo)、產(chǎn)量及品質(zhì)下降甚至絕產(chǎn)。這對周邊人群飲食安全產(chǎn)生嚴(yán)重威脅（林強，2004）。不同重金屬之間存在加和、協(xié)同、拮抗等作用，使復(fù)合重金屬污染機制比單一重金屬污染污染機制更加復(fù)雜（曹心德等，2011），因此復(fù)合污染越來越受到關(guān)注，并逐漸成為環(huán)境科學(xué)的重要研究方向之一。目前復(fù)合重金屬污染的修復(fù)技術(shù)有物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)、物理化學(xué)修復(fù)和生物修復(fù)。物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)、物理化學(xué)修復(fù)技術(shù)具有時效性強、見效快的特點，但普遍存在治理成本較高、修復(fù)后易產(chǎn)生重金屬再活化等缺點（陳桂榮等，2010）。植物修復(fù)相對于物理、化學(xué)修復(fù)具有成本低、治理效果好的優(yōu)點（黃占斌和焦海華，2012），因此在土壤重金屬修復(fù)領(lǐng)域逐漸受到青睞。近年來，隨著植物修復(fù)在重金屬污染場地的應(yīng)用，其生長慢、生物量小、修復(fù)效率低等缺點漸漸暴露出來。因此急需尋找富集量大的植物和改進措施。

苧麻是我國特產(chǎn)的多年生草本宿根植物，具有生物量大、根系發(fā)達、繁殖力旺盛及抗逆性強的特點（曹詣等，2014）。同時它對As（Leung et al，2006） 、Cd（Liu et al，2003） 、Pb（黃閨等，2013）、Sb（Okkenhaug et al，2011）等單一重金屬均具有富集作用。佘瑋等（2011）在研究湖南石門、冷水江、瀏陽3個礦區(qū)的野生苧麻時發(fā)現(xiàn)苧麻對Cd、As、Sb等重金屬的富集比一般植物大2 — 338.4倍，且富集系數(shù)與轉(zhuǎn)運系數(shù)均大于1，滿足土壤復(fù)合重金屬污染超富集植物的特征。同時苧麻還是具有大生物量的經(jīng)濟作物，可以作為造紙、建筑材料等原材料（劉瑛等，2003），因此苧麻是理想的應(yīng)用于土壤復(fù)合重金屬污染修復(fù)的植物材料。

AM真菌是一類廣泛存在的土壤真菌，能夠與80%以上陸地植物形成共生體（Wang and Shi，2008）。大量研究發(fā)現(xiàn)（陳保東等，2005；申鴻等，2005；Madejón et al，2010）AM 真菌不僅可以通過菌絲直接參與重金屬的吸收，還可以通過改變植物的生理生態(tài)等方式間接來改善植物生長狀況，從而減輕重金屬對植物的毒害作用；同時能夠調(diào)節(jié)植物對重金屬的吸收和轉(zhuǎn)運，加快土壤中重金屬的植物提取或植物穩(wěn)定（Miransari，2011）。因此AM真菌與植物形成的菌根使其在重金屬污染土壤的修復(fù)上優(yōu)于單一植物修復(fù)。

苧麻雖然對多種重金屬具有富集作用，但重金屬濃度過高會抑制苧麻的生長（趙丹博等，2015），影響苧麻對重金屬吸收，從而降低重金屬污染土壤的修復(fù)效果。而AM真菌通過改善植物營養(yǎng)條件、根系生理生態(tài)等方式改善植物生長狀況，促進植物生長，在一定程度上緩解重金屬對植物的“毒害”。前期對湖南錫礦山重金屬污染土壤分析發(fā)現(xiàn)，AM 真菌與植物的共生關(guān)系普遍存在，并能夠提高植物對重金屬的耐受性。Wei et al（2015）在研究利用植物與微生物聯(lián)合修復(fù)重金屬Sb污染土壤時發(fā)現(xiàn)，AM真菌能夠與苧麻形成菌根，苧麻體內(nèi)的Sb含量與 AM 真菌侵染率呈顯著正相關(guān)。因此推測：在復(fù)合重金屬脅迫條件下，AM真菌與苧麻能夠形成菌根并可以改善復(fù)合苧麻的生長環(huán)境及對重金屬的吸收和轉(zhuǎn)運，提高苧麻對復(fù)合重金屬的耐受性。但是現(xiàn)在還沒有直接的試驗研究AM真菌-苧麻聯(lián)合對復(fù)合重金屬修復(fù)的作用。本文利用溫室接種與非接種對比試驗，從植物生長、復(fù)合重金屬吸收與抗氧化酶系統(tǒng)三方面對該過程初步探討，有助于更好地了解AM真菌-苧麻聯(lián)合修復(fù)的效果及作用，為復(fù)合重金屬污染土壤修復(fù)提供一種新的解決方法。

1 材料與方法

1.1 供試植物

供試植物為湘苧3號，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)苧麻研究所提供，幼苗取回后種植在經(jīng)高壓蒸汽滅菌的干凈土壤中，每隔3日噴灑霍蘭格營養(yǎng)液以保證苧麻幼苗的正常生長。供試礦區(qū)土壤取自于距離湖南錫礦山某尾礦附近約1千米的農(nóng)田土壤。經(jīng)測定土壤中的 TOC 含量為 3.64 g ? kg?1，全氮為 0.77 g ? kg?1，速效氮為 93.20 mg ? kg?1，速效磷為 5.21 mg ? kg?1，速效鉀為 57 mg ? kg?1。全 Sb 為77.08 mg ? kg?1， 全 Cd 為 12.67 mg ? kg?1，全 Zn 為176.84 mg ? kg?1， 全 As 為 153.81 mg ? kg?1， 全 Cu為 24.81 mg ? kg?1，pH 為 8.36。

1.2 菌根接種劑

摩西球囊霉Glomus mosseae（BGC NM04A）購自北京市農(nóng)林科學(xué)研究院植物營養(yǎng)與資源研究所。接種劑含有寄主植物根段、相應(yīng)菌根真菌孢子及根外菌絲體的根際土壤。

1.3 試驗設(shè)計

根據(jù)試驗要求，試驗設(shè)計了1個非接種組，1個接種組，每組設(shè)置5個重復(fù)，共計10盆。試驗土壤采用高溫蒸汽滅菌2 h。將8.5 kg土壤裝入口徑為35 cm，底內(nèi)徑為20 cm，高為25 cm的塑料盆中。準(zhǔn)確秤取接種劑100 g，用18目塑料篩將接種劑均勻撒在土壤上面，再將剩余1.5 kg土壤均勻地覆在接種劑上面。非接種組則加入等量滅菌的過濾液（120℃，0.1 MPa，30 min）。上述完成后將土壤用去離子水調(diào)節(jié)到田間持水率的75%，在生長期間內(nèi)通過稱重法，加入去離子水維持盆栽中含水量。將2棵高度25 cm左右大小、長勢相似的幼苗用10% H2O2淋洗2 — 3次，去離子水沖洗3 — 5次后移栽到試驗盆中。

試驗設(shè)置在中國環(huán)境科學(xué)研究院溫室內(nèi)，室內(nèi)控制溫度在23 — 28℃，保持光照14 h，黑暗10 h，光照時間不足的以60 w日光燈來補充，苧麻生長80 d后收獲。

1.4 樣品分析與測定方法

1.4.1 苧麻侵染率測定

侵染率采用醋酸墨水染色法（Vierheilig et al，2005）測定。

1.4.2 苧麻生物量測定

將收獲后的苧麻從泥土中連根取出，先用自來水將其洗凈，再用去離子水將其洗滌3 — 5次。最后用陶瓷剪刀將根、莖葉分開，晾干后放入到105℃烘箱中殺青30 min，用鼓風(fēng)干燥箱80℃烘干至恒重，測定根、莖葉的生物量。

1.4.3 苧麻不同部位重金屬含量測定

用陶瓷剪刀分別在苧麻上取若干莖葉（地上部）以及根（地下部）。先用自來水、后用去離子水清洗，用濾紙將水吸干后分別編號，并放入冷凍干燥器中冷凍干燥。分別秤取干燥后的根、莖葉0.1 g置于6 mL 混合消解液（65%的HNO3和 30%的 H2O2按體積比5∶1混合）中，150℃電熱板消解2 h，趕酸至1 mL，冷卻后用質(zhì)量分數(shù)為1%的HNO3清洗并轉(zhuǎn)移至25 mL的容量瓶中，定容后過0.45 μm的聚醚撒濾膜，ICP-MS測定重金屬Cu、Zn、As、Cd、Sb的濃度，測定的值為3次重復(fù)后所取的平均值。轉(zhuǎn)運系數(shù)計算公式為：轉(zhuǎn)運系數(shù) =苧麻地上部重金屬含量（mg ? kg?1）/苧麻地下部重金屬含量（mg ? kg?1）。

1.4.4 苧麻地上部分全磷的測定

稱取經(jīng)冷凍干燥苧麻莖葉0.5 g，置于50 mL消煮管中。先滴入少許水濕潤樣品，然后加8 mL硫酸，輕輕搖勻并放置過夜。在管口放一彎頸小漏斗，在消煮爐上經(jīng)250℃消煮（溫度穩(wěn)定后計時，時間約30 min），待H2SO4分解冒出大量白煙后再升高溫度至400℃，當(dāng)溶液呈均勻的棕黑色時取下。稍冷后加10滴H2O2搖勻，再加熱至微沸，消煮約5 min，取下稍冷后，重復(fù)加入5滴H2O2，再消煮。多次重復(fù)直至消煮到溶液呈無色或清亮，繼續(xù)加熱約5 — 10 min，除盡剩余的H2O2，取下冷卻至室溫。多次用少量水沖洗彎頸漏斗，把沖洗液加入消煮管。將消煮液無損轉(zhuǎn)移入100 mL容量瓶中，定容，搖勻。溶液用無磷濾紙過濾，用紫外分光光度計在波長450 nm處測定吸光度。稀釋KH2PO4，分濃度梯度做標(biāo)準(zhǔn)液，在450 nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及所測數(shù)據(jù)計算苧麻地上部磷的濃度。

1.4.5 苧麻葉片中抗氧化性酶的測定

取苧麻組織葉片，同1.4.2過程清洗，用濾紙將葉片表面水分吸干，秤取0.3 g葉片，在液氮條件下將其磨成粉末，加入3 mL提取緩沖液（2.991 mL 0.1 mol ? L?1K2HPO4-KH2PO4（pH 7.6），8.77×10?4g EDTA，0.009 mL Triton X-100，0.06 g PVP）。在冰浴條件下，加入少量石英砂并研磨成勻漿。4℃高速離心（10000 r ? min?1，20 min），取上清液于 10 mL離心管中，?70℃低溫保存。用于測定抗氧化酶活性。采用氮藍四唑比色法（李合生，2000）測定SOD活性，采用Kn?rzer et al（1996）文中方法測定CAT活性，采用愈創(chuàng)木酚法（Chance and Maehly，1955）測定POD活性。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理及分析

所有數(shù)據(jù)采用Excel 2010處理，進行均值及標(biāo)準(zhǔn)差的計算，并使用統(tǒng)計分析軟件SPSS 17.0對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，檢驗各處理平均值之間的差異顯著性。所有圖件采用Origin 9.1處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種叢枝菌根真菌對苧麻侵染情況

接種AM真菌后，其侵染率為33.7%（圖1）。

圖1 AM真菌侵染苧麻根部顯微結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Microstructure of AM fungi infect the root of ramie

2.2 接種叢枝菌根真菌對苧麻生物量和磷的影響

不同處理對苧麻地上部和地下部生物量的影響如圖2所示：在復(fù)合重金屬脅迫下，接種AM真菌顯著增加苧麻地上部和地下部生物量（P ＜ 0.05），與非接種組相比，分別增加22.2%和24.0%。

圖2 接種AM真菌對苧麻地上部和地下部生物量的影響Fig.2 Effects of AM fungi on the biomass of aboveground and underground parts of ramie

不同處理對苧麻地上部磷含量的影響如圖3所示：接種AM真菌顯著提高苧麻地上部磷含量（P ＜ 0.05），與非接種組相比提高50.4%。

2.3 接種叢枝菌根真菌對苧麻吸收、轉(zhuǎn)運重金屬的影響

不同處理對苧麻地上部重金屬含量影響如圖4所示：在復(fù)合重金屬脅迫條件下，接種AM真菌顯著提高苧麻地上部Zn和Cd的含量（P ＜ 0.05），與非接種組相比，分別提高50.3%和100.0%，說明AM真菌促進苧麻地上部對Zn和Cd的吸收；然而接種AM真菌顯著降低苧麻地上部As含量（P ＜ 0.05），與非接種組相比，降低121.6%，說明AM真菌抑制苧麻地上部對As的吸收；接種AM真菌對苧麻地上部吸收Cu、Sb無顯著影響。

圖3 接種AM真菌對苧麻地上部磷含量的影響Fig.3 Effects of AM fungi on P content in ramie aboveground

不同處理對苧麻地下部重金屬含量的影響如圖5所示：在復(fù)合重金屬脅迫條件下，接種AM真菌顯著提高苧麻地下部Cu、Sb含量（P ＜ 0.05），與非接種組相比，分別提高30.4%和114.3%，說明接種AM真菌促進苧麻地下部對Cu和Sb的吸收；然而接種AM真菌顯著降低苧麻地下部As含量（P ＜ 0.05），降低416.4%，說明AM真菌抑制苧麻地下部對As的吸收；同時，接種AM真菌對苧麻吸收Zn、Cd無顯著影響。

不同處理對苧麻轉(zhuǎn)運系數(shù)的影響如圖6所示：在復(fù)合重金屬污染條件下，接種AM真菌顯著增加苧麻中Zn、As和Cd的轉(zhuǎn)運系數(shù)（P ＜ 0.05），與非接種組相比，分別提高58.6%、148.1%和49.8%，說明接種AM真菌促進苧麻中Zn、As、Cd由地下部向地上部轉(zhuǎn)運；然而卻顯著降低苧麻中Sb的轉(zhuǎn)運率（P ＜ 0.05），與非接種組相比，降低64.1%，說明AM真菌抑制苧麻中Sb由地下部向地上部轉(zhuǎn)運；接種AM真菌對苧麻中Cu的轉(zhuǎn)運無顯著影響。

圖4 接種AM真菌對苧麻地上部重金屬含量的影響Fig.4 Effects of AM fungi on the content of heavy metals in ramie aboveground

圖5 接種AM真菌對苧麻地下部重金屬含量的影響Fig.5 Effects of AM fungi on the content of heavy metals in ramie underground

2.4 接種叢枝菌根真菌對苧麻超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶活 性的影響

苧麻地上部抗氧化系統(tǒng)酶的變化如圖7所示：在復(fù)合重金屬脅迫條件下，接種AM真菌能夠提高苧麻地上部SOD、CAT、POD活性。接種組苧麻地上部SOD和CAT活性分別顯著提高了（P ＜ 0.05）17.47%和31.75%。 接種組苧麻地上部POD活性提高6.75%，但較非接種組無顯著差異。

圖6 接種AM真菌對苧麻轉(zhuǎn)運重金屬的影響Fig.6 Effects of AM fungi on heavy metal transport from ramie

圖7 接種AM真菌對苧麻地上部SOD、POD、CAT活性的影響Fig.7 Effects of AM fungi on SOD, CAT and POD activities in ramie of shoots

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)在復(fù)合重金屬脅迫條件下，AM真菌能夠與苧麻形成良好共生關(guān)系，其侵染率為33.7%。這與Wei et al（2015a）結(jié)論相似，其發(fā)現(xiàn)在重金屬Sb脅迫條件下，AM真菌能夠成功侵染苧麻形成菌根，且苧麻體內(nèi)的Sb含量與 AM 真菌侵染率呈顯著正相關(guān)關(guān)系。本研究還發(fā)現(xiàn)接種組苧麻地上部和地下部生物量顯著增加，表明AM真菌能夠緩解復(fù)合重金屬對苧麻的毒害作用。AM真菌促進苧麻生物量增加的重要原因是它能夠通過改善植物的磷營養(yǎng)狀態(tài)，促進植物對磷的吸收（圖3）。磷是植物的必需養(yǎng)分之一，磷缺失會嚴(yán)重影響植物的各種生理生化活動。而重金屬Cu2+、Cd2+、Zn2+等離子均可與、發(fā)生反應(yīng)，使土壤溶液中、的有效性降低，造成植物吸磷困難（羅巧玉等，2013）。AM真菌不僅能夠通過外生菌絲的延伸，擴大植物根系的范圍和根的吸收面積，提高植物對磷的吸收，還可以通過菌絲分泌乙酸、檸檬酸等有機酸活化土壤中的難溶性磷酸鹽（Hodge et al，2010），促進植物對磷的吸收，增強植物對磷的可利用性。此外，AM真菌能夠通過提高根系磷酸酶的分泌，促進土壤中有機磷的分解，轉(zhuǎn)化為能被植物直接吸收利用的無機磷，改善菌根植物磷素營養(yǎng)狀況。劉進法等（2008）在研究AM真菌對枳吸收利用磷酸鋁的影響時發(fā)現(xiàn)，接種AM真菌能夠顯著提高根系與菌絲磷酸酶的分泌，促使有機磷酸酯水解為無機態(tài)的磷酸，從而提高植物對土壤中磷元素的吸收，增加枳的干重。李霞等（2014）的試驗結(jié)果也顯示在復(fù)合重金屬脅迫條件下，接種AM真菌的植物地上部的磷含量顯著提高，生物量增加，植物對重金屬的耐受性增強。

接種AM真菌顯著促進苧麻地上部對Zn、Cd的吸收，并顯著提高苧麻中Zn、Cd由地下部向地上部的轉(zhuǎn)運，Wang et al（2007）在研究重金屬污染場地接種AM真菌對玉米生長的影響發(fā)現(xiàn)，接種易誤巨胞囊霉（G. decipiens）后，玉米地上部對Zn、Cd的吸收得到顯著提高，同時提高了Zn、Cd的轉(zhuǎn)運效率。 此外，研究還發(fā)現(xiàn)接種AM真菌顯著促進苧麻地下部對Cu、Sb的吸收，并同時抑制兩種重金屬向地上部轉(zhuǎn)運，說明接種AM真菌能夠?qū)u、Sb大量固持在苧麻根部。大量研究認為，AM真菌菌絲對重金屬具有“ 過 濾” 作 用。González-Guerrero et al（2008）利用TEX/SEM-EDAX發(fā)現(xiàn)Cu主要積累在菌絲壁的黏液層、細胞壁和菌絲細胞質(zhì)中。陳志鵬等（2015）研究發(fā)現(xiàn)接種AM真菌促進紫花苜蓿地下部對Sb的吸收并抑制Sb向地上部轉(zhuǎn)運。同時，本研究也發(fā)現(xiàn)接種AM真菌抑制了苧麻對As的吸收，但苧麻中As的轉(zhuǎn)運系數(shù)提高。這與Trotta et al（2006）研究結(jié)果相似。他們研究發(fā)現(xiàn)，接種株狀球囊霉的植物地上部與地下部As的含量顯著降低，但As的轉(zhuǎn)運系數(shù)增加。這可能是由于磷和As的吸收都是通過磷酸鹽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（Wang et al，2002）進入植物體內(nèi)，存在競爭關(guān)系，促進磷吸收的同時降低As的吸收?？傮w來講，在復(fù)合重金屬脅迫條件下，菌根化的苧麻能夠促進Cu、Zn、Cd、Sb的吸收。

在重金屬脅迫條件下，植物被重金屬誘導(dǎo)產(chǎn)生 大量的 O2??、H2O2等 活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS導(dǎo)致氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，從而損傷細胞。而在抗氧化酶系統(tǒng)中，SOD能夠清除 O2??而產(chǎn)生 H2O2，CAT 和 POD 可以將 H2O2分解，有效減少植物細胞受到的損傷（Scandalios，1993）。本研究發(fā)現(xiàn)在復(fù)合重金屬脅迫條件下，接種組抗氧化系統(tǒng)酶中的SOD和CAT、POD活性提高。這與 Márquez-García and Córdoba （2010）的結(jié)論相似。張旭紅等（2008）試驗也發(fā)現(xiàn)，復(fù)合重金屬脅迫條件下，蠶豆接種摩西球囊霉后，抗氧化酶的活性顯著增強。在復(fù)合重金屬脅迫下，接種AM真菌促使苧麻地上部分的SOD、CAT、POD活性增加，從而能夠較好地清除活性氧，降低植物細胞的損傷，提高苧麻對復(fù)合重金屬的耐性。

本研究旨在通過探究AM真菌-苧麻聯(lián)合體對復(fù)合重金屬污染土壤的修復(fù)效率，為我國南方土壤復(fù)合重金屬污染修復(fù)尋找一種新的技術(shù)方法。試驗初步探究發(fā)現(xiàn)AM真菌-苧麻聯(lián)合體對復(fù)合重金屬污染土壤具有一定的修復(fù)作用。但本研究是在環(huán)境條件可控的溫室條件下從苧麻生物量、地上部磷的含量、重金屬吸收與轉(zhuǎn)運、苧麻體內(nèi)抗氧化酶的變化等方面對AM真菌-苧麻聯(lián)合修復(fù)重金屬污染土壤進行了初步探究，對于AM真菌-苧麻聯(lián)合體對復(fù)合重金屬修復(fù)的具體機制有待進一步研究。

4 結(jié)論

（1）室內(nèi)盆栽試驗結(jié)果表明：在復(fù)合重金屬脅迫下，AM真菌能夠與苧麻形成菌根，并顯著提高苧麻地上部對磷的吸收，改善了苧麻的生長狀況，促進生物量的增加，提高苧麻對重金屬的耐受性。

（2）接種AM真菌調(diào)節(jié)苧麻對多種重金屬的吸收狀況。AM真菌-苧麻聯(lián)合體可以作為利用微生物-植物聯(lián)合體修復(fù)復(fù)合重金屬污染的一種新的方法。

（3）接種AM真菌顯著增加苧麻地上部分SOD和CAT的活性，同時對POD的活性也有一定促進作用。

致謝：感謝秦寧博士對試驗的指導(dǎo)，感謝陳志鵬在試驗樣品處理過程中的幫助。