楊中義，尚嘉琪，趙夏陸，趙 靚，張春來，呂晉慧*

(1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山西太谷 030801；2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西太谷 030801)

花色苷是高等植物體內(nèi)主要的呈色物質(zhì)，由一系列花色苷結(jié)構(gòu)基因編碼的關(guān)鍵酶所催化合成，其生物合成途徑在矮牽牛、金魚草、葡萄和玉米等模式植物中研究較為成熟[1]，參與編碼關(guān)鍵酶的結(jié)構(gòu)基因主要有PAL(phenylalanine ammonialyase)、CHS(chalcone synthase)、CHI(chalcone isomerase)、F3H(flavanone3-hydroxylase)、DFR(dihydroflavonol4-reductase)、ANS(anthocyanidin synthase)及UFGT(flavonoid3-O-glucosyl-transferase)等，其中UFGT是植物花色苷生物合成所必需的[2]。蝴蝶蘭紅色花中UFGT表達(dá)豐度顯著高于白色花[3]。藍(lán)花龍膽中UFGT大量表達(dá)，且積累量顯著高于白花龍膽[4]。孫磊[5]、Kobayashi等[6]和Boss等[7]在葡萄果皮中也有相似發(fā)現(xiàn)，黑果葡萄果皮中UFGT表達(dá)量顯著高于白果葡萄。除遺傳因素，植物花或果實(shí)的著色還受外部環(huán)境影響[8]。環(huán)境因子(光照[8-10]、溫度[11-12]、紫外輻射[12]等)不僅影響花色苷生物合成速率，而且對其積累量和穩(wěn)定性也有明顯影響。其中，光照是影響紫馬鈴薯塊莖花青素合成的重要因素，増加光照強(qiáng)度能夠不同程度提高其花青素含量、花青素積累量及花青素合成關(guān)鍵酶活性[10]。遮光處理可導(dǎo)致葡萄果皮花色苷含量減少[13]。隨著遮光率的升高，滇山茶花瓣花青素苷含量呈先升后降的變化趨勢[14]。張孟夏[9]認(rèn)為光照強(qiáng)度調(diào)控花色苷的合成，與其調(diào)控UFGT基因表達(dá)和UFGT酶活性相關(guān)。以上研究多集中于光在花色苷合成代謝途徑的調(diào)控機(jī)制?；ㄩ_放后期，光對花色苷的合成作用逐漸減弱，光是否導(dǎo)致花色苷降解以及遮光能否延緩花色苷降解尚無定論。因此，本研究以地被菊品種‘紫重樓’為試材，在花發(fā)育的不同時(shí)期對其進(jìn)行不同程度的遮光處理，檢測花色苷含量和UFGT結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)情況，分析光在花色苷合成和降解過程中的調(diào)控機(jī)制，旨在為進(jìn)一步深入研究菊花花色苷代謝的分子調(diào)控機(jī)制奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

2014年5月將生長健壯、長勢一致的地被菊(Chrysanthemummorifolium)品種‘紫重樓’按照株行距50 cm×50 cm定植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院林業(yè)站(Alt：803 m，E112°34′34″，N37°25′24″)試驗(yàn)田中，種植基質(zhì)為沙壤土，正常水肥管理。其中，‘紫重樓’為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)培育的優(yōu)良地被菊品種，株型緊湊、開花繁茂、花瓣紫色、重瓣性高，盛花期9月中旬。

分別于現(xiàn)蕾期(花蕾直徑1～2 mm)、露色期(透過花蕾總苞可看到花朵顏色，即花序發(fā)育第3階段)、盛花期(50%～70%的花序完全開放，即花序發(fā)育第5階段)對植株進(jìn)行遮光處理，使用不同透光率的黑色遮陰網(wǎng)進(jìn)行遮光處理，遮光棚南北方向，高1.3 m，寬2.5 m，南北敞開，便于通風(fēng)透氣。遮光度通過增加遮陰網(wǎng)的層數(shù)來調(diào)整，并且用照度計(jì)測定。設(shè)置4種光環(huán)境梯度：L0(CK，全光照)、L1(1層遮陰網(wǎng)，80%全光照)、L2(2層遮陰網(wǎng)，60%全光照)和L3(3層遮陰網(wǎng)，40%全光照)。遮光處理時(shí)間為每天9:00～18:00，花衰敗后停止處理，每處理20株，3次重復(fù)。期間各處理及對照的其他水肥管理相同。

根據(jù)韓科廳等[15]、尚嘉琪等[16]對菊花花序發(fā)育順序的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將‘紫重樓’花序發(fā)育順序分為8個(gè)階段(圖1)，分別是(1)花蕾，直徑0.5～0.6 cm；(2)花蕾，直徑0.8～1 cm；(3)花蕾，直徑1.0～1.2 cm，少數(shù)舌狀花微伸出總苞；(4)舌狀花完全伸出總苞，外輪舌狀花充分著色，直立，未平伸；(5)2～3輪舌狀花平伸；(6)4～6輪舌狀花平伸；(7)7～9輪舌狀花平伸；(8)中間管狀花全部開放，舌狀花褪色。

1.2 測定指標(biāo)及方法

1.2.1葉綠素含量的測定盛花期隨機(jī)取植株第3～4節(jié)位葉片，參照李合生等[17]方法測定葉綠素含量。

1.2.2干重和干重比的測定于處理前標(biāo)記相同部位、大小一致的花蕾，遮光后，待花序發(fā)育至第8階段，稱量花序(舌狀花、管狀花和子房等)鮮重。在105 ℃烘箱中殺青15 min，80 ℃烘干至恒重，稱量干重。干重比=干重/鮮重。

1.2.3花色苷含量的測定稱取0.1 g舌狀花，加入1 mL提取液(甲醇∶鹽酸=99∶1,V/V)，研磨成勻漿，定容至5 mL，振蕩15 min，8 500×g離心15 min后，吸取上清液。以鹽酸甲醇為空白對照，測定波長525 nm下提取液的吸光度(OD)。

計(jì)算公式[18]為：花色苷含量(mg/kg)=(100×A×Mw×DF)/ε×1

式中，A為吸光度；Mw為矢車菊素-3-葡萄糖苷分子量(449.2)；DF為稀釋倍數(shù)；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)(取26 900)；1為比色皿光程(1 cm)。

1.2.4可溶性糖含量的測定取不同花序發(fā)育階段的舌狀花，105 ℃殺青15 min，80 ℃烘干至恒重，釆用蒽酮比色法[17]測定可溶性糖含量。

1.2.5CmUFGT基因相對表達(dá)量的測定取0.1 g舌狀花，液氮速凍，保存于超低溫冰箱中備用。采用改良Trizol法[19]提取RNA，使用TaKaRa試劑盒Prime ScriptTMRT Master Mix反轉(zhuǎn)錄。以菊花Actin基因作為內(nèi)參基因，引物為Actin-F(5′-CCAAAAGCCAATCGTGAGAAG-3′)與Actin-R(5′-CACCATCACCAGAATCCAACA-3′)，采用TaKaRa SYBRTMPremix Ex TagTM Ⅱ試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR，對UFGT表達(dá)進(jìn)行檢測。引物為UFGT-F(5′-GCCTTGTTCGATGTTTCAGTG-3′)與UFGT-R(5′-AGATCACAGGGACTAGCAACC-3′)，預(yù)測產(chǎn)物長度為166 bp，每個(gè)樣3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010和SPSS 17.0等軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和多重比較(LSD法)。不同大小寫字母分別表示在P<0.01和P<0.05水平上差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 遮光對‘紫重樓’葉片葉綠素含量的影響

現(xiàn)蕾期、露色期，L3處理下葉綠素a、b含量顯著高于其他處理；盛花期，L1處理下葉綠素a、b含量極顯著高于其他處理(表1)。現(xiàn)蕾期和露色期遮光處理下，葉綠素a、b含量隨光照強(qiáng)度的降低而逐漸增加，且L1和L2處理間差異不顯著。其中，露色期L1和L2處理下葉綠素a、b含量極顯著高于L0，葉綠素a顯著低于L3，葉綠素b極顯著低于L3。盛花期，L1、L2和L3處理下葉綠素a、b含量顯著高于L0?，F(xiàn)蕾期各處理間Chla/b無顯著差異。露色期和盛花期L1和L2處理下Chla/b差異不顯著，但顯著低于L0，其中盛花期L1、L2處理下Chla/b顯著低于L3。

圖1 地被菊‘紫重樓’頭狀花序不同發(fā)育時(shí)期分級(jí)[16]Fig.1 Developmental stages of chrysanthemum ‘Zichonglou’ capitulum[16]

表1 不同時(shí)期遮光對葉片葉綠素含量及花序干重、干重比的影響

注：不同大(小)寫字母表示不同時(shí)期遮光處理下差異顯著性達(dá)0.01(0.05)水平Note： different capital (normal) letters, indicate the shading treatments at different florescence stages were significantly different at the 0.01 (0.05) level

2.2 遮光對‘紫重樓’花序干重、干重比的影響

隨著光照強(qiáng)度的降低，花序干重呈下降趨勢，花序干重比呈先升后降的趨勢；不同時(shí)期遮光，L1處理下花序干重比增加(表1)。方差分析表明，現(xiàn)蕾期L0和L1處理下花序干重和干重比差異不顯著，但極顯著高于L2和L3。露色期和盛花期L0、L2和L3處理下花序干重比差異不顯著，但極顯著低于L1。露色期L0和L1處理下花序干重差異不顯著，但極顯著高于L2和L3。盛花期L0、L1和L3處理下干重差異不顯著，但極顯著高于L2。

2.3 遮光對‘紫重樓’不同發(fā)育階段舌狀花花色苷含量的影響

現(xiàn)蕾期、露色期遮光處理下花色苷含量隨著花序發(fā)育呈先升后降趨勢，盛花期遮光處理下呈下降趨勢。花序發(fā)育第3、4階段，光照越強(qiáng)花色苷含量越高；第7、8階段，光照越弱花色苷含量越高(圖4)?，F(xiàn)蕾期，第3、4階段遮光處理下花色苷含量降低；第5、6階段L1處理下花色苷含量極顯著高于其他處理；第8階段遮光處理下花色苷含量顯著高于L0(圖2,Ⅰ)。露色期和盛花期，第8階段遮光處理下花色苷含量極顯著增加。露色期，第3至第6階段花色苷含量隨光照強(qiáng)度的降低而逐漸降低；第4階段，L0處理下花色苷含量極顯著高于其他處理；第5、6階段，L0處理下花色苷含量極顯著高于L3；第7階段，L0、L1和L2處理下花色苷含量差異不顯著，但極顯著高于L3(圖2,Ⅱ)。盛花期，第5、6階段，L1處理下花色苷含量分別極顯著、顯著高于L0；第7階段，L3處理下花色苷含量極顯著高于其他處理(圖2,Ⅲ)。

2.4 遮光對‘紫重樓’不同發(fā)育階段舌狀花可溶性糖含量的影響

遮光處理下舌狀花可溶性糖含量隨著花序發(fā)育總體呈先升后降趨勢，L1處理下可溶性糖含量增加(圖3)。

現(xiàn)蕾期，L1處理下可溶性糖含量高于L0。第1、2階段，L1和L2處理下舌狀花可溶性糖含量顯著高于L0，L3處理下可溶性糖含量顯著低于L0；第3階段，L3處理下可溶性糖含量極顯著低于L0，L1、L2處理下可溶性糖含量與L0差異不顯著；第4階段，L1處理可溶性糖含量極顯著高于其他處理；第5至第8階段，L1處理可溶性糖含量顯著高于L0(圖3，Ⅰ)。

Ⅰ.現(xiàn)蕾期；Ⅱ.露色期；Ⅲ.盛花期遮光；1～8發(fā)育階段同圖1；不同大(小)寫字母表示不同時(shí)期遮光處理下差異顯著性達(dá)0.01(0.05)水平。下同圖2 不同時(shí)期不同遮光處理對花色苷含量的影響Ⅰ.Visible flower bud stage；Ⅱ. Visible flower color stage； Ⅲ.Full-bloom stage; 1-8 Development stages are same as Fig.1； Different capital (normal) letters indicate the shading treatments at different florescence stages were significantly different at the 0.01 (0.05) level. The same as belowFig.2 The effect of shading at different stages on the anthocyanin content in each stage

露色期，第3階段L0處理下可溶性糖含量極顯著高于其他處理；第4至第8階段，L1處理下可溶性糖含量顯著高于其他處理(圖3，Ⅱ)。

盛花期，第5階段L2處理下可溶性糖含量顯著高于L0；第6至第8階段，L1處理下可溶性糖含量顯著高于L0(圖3，Ⅲ)。

2.5 遮光對‘紫重樓’舌狀花CmUFGT表達(dá)的影響

現(xiàn)蕾期(圖4，Ⅰ)、露色期(圖4，Ⅱ)遮光處理下，花序發(fā)育第4階段CmUFGT表達(dá)量顯著高于其他階段，其中L1處理下，第3、4階段CmUFGT的表達(dá)量均降低；盛花期(圖4，Ⅲ)遮光處理下，第5階段CmUFGT表達(dá)量顯著高于其他階段。遮光處理極顯著抑制花序發(fā)育第5階段CmUFGT的表達(dá)，且表達(dá)量隨著光照強(qiáng)度的降低而逐漸降低。

現(xiàn)蕾期(圖4，Ⅰ)遮光處理下，CmUFGT的表達(dá)量隨著花序的發(fā)育呈先升后降趨勢。第1、2階段，L3處理下CmUFGT基因表達(dá)量極顯著高于其他處理；第3至第5階段，CmUFGT的表達(dá)量隨光照強(qiáng)度的降低逐漸降低，L0處理下CmUFGT表達(dá)量極顯著高于其他處理；第6階段L1和L2處理下CmUFGT表達(dá)量極顯著高于L0和L3處理；第7階段L0、L1處理下CmUFGT表達(dá)量極顯著高于L2和L3；第8階段L3處理下CmUFGT基因表達(dá)量顯著高于其他處理。

露色期(圖4，Ⅱ)遮光處理顯著影響不同發(fā)育階段CmUFGT基因表達(dá)。L0、L1和L2處理下CmUFGT表達(dá)量隨著花序的發(fā)育呈先升后降趨勢，L3處理下CmUFGT表達(dá)量呈下降趨勢。第5階段，CmUFGT基因表達(dá)量隨著光照強(qiáng)度的降低呈下降趨勢，且各處理間差異達(dá)極顯著水平；第6、第8階段L1處理下CmUFGT表達(dá)量極顯著高于其他處理。

圖3 不同時(shí)期不同遮光處理對可溶性糖含量的影響Fig.3 The effect of shading at different stages on the soluble sugar content in each stage

盛花期(圖4，Ⅲ)，L0處理下CmUFGT表達(dá)量呈下降趨勢，L1處理下CmUFGT表達(dá)量呈先升后降再升的趨勢，L2處理下CmUFGT表達(dá)量呈先降后升趨勢，L3處理下CmUFGT持續(xù)低水平表達(dá)。第5至第7階段，遮光處理極顯著抑制CmUFGT表達(dá)，L1、L2、L3處理下CmUFGT表達(dá)量極顯著低于L0；第8階段，L1處理下CmUFGT表達(dá)量極顯著高于其他處理。

3 討 論

花色素在植物體內(nèi)極不穩(wěn)定，糖基化修飾能夠提高其穩(wěn)定性[20]。UFGT基因調(diào)控花色素糖基化[21]。UFGT酶是光調(diào)節(jié)酶[22]，UFGT基因的表達(dá)受光調(diào)節(jié)[23]。本研究中，現(xiàn)蕾期遮光處理下，花序發(fā)育第1、2階段L3處理下CmUFGT基因表達(dá)量極顯著高于其他處理，可能與低光脅迫誘導(dǎo)CmUFGT基因表達(dá)有關(guān)[24]。這說明花序發(fā)育前期重度遮光極顯著促進(jìn)CmUFGT基因表達(dá)。第3至第5階段 L0處理下CmUFGT表達(dá)量極顯著高于其他處理，說明花序發(fā)育中期遮光極顯著抑制CmUFGT基因表達(dá)。露色期遮光處理下，第4、5階段CmUFGT表達(dá)量極顯著降低，花色苷含量降低，說明CmUFGT的表達(dá)與花色苷的積累密切相關(guān)[4,21]。這與張孟夏[9]、吳翠平等[10]、韓科廳等[15]的研究結(jié)果一致。盛花期遮光處理下，第5至第7階段CmUFGT基因的表達(dá)極顯著低于L0，但花色苷含量變化與之相反。這可能是花發(fā)育后期CmUFGT基因表達(dá)下調(diào)，花色苷合成減少，花色苷降解加快，但遮光形成的低溫環(huán)境延緩了花色苷的降解，因此花色苷含量高于全光照。

花色苷是花色素與糖以糖苷鍵結(jié)合而成的一類化合物[25]。凡能導(dǎo)致細(xì)胞中糖分積累的因素都在不同程度上促進(jìn)花色苷的合成[23]。光為光合作用提供能量。同時(shí)，植物通過調(diào)整葉綠素含量以適應(yīng)不同強(qiáng)度的光照[26]。本研究中現(xiàn)蕾期、露色期遮光處理下葉綠素a、b含量顯著增加，Chla/b值降低，有利于光合作用的進(jìn)行。究其原因，可能是植物對遮光脅迫的生態(tài)適應(yīng)。這也與侯興亮等[27]、周翠麗[28]的研究結(jié)果一致。同時(shí)遮光降低了試驗(yàn)區(qū)域小環(huán)境的溫度，植物呼吸速率下降，碳水化合物的消耗減少，有利于糖分的積累。因此現(xiàn)蕾期、露色期遮光處理下可溶性糖含量高于L0。不同時(shí)期遮光，L1處理下花序干重比、可溶性糖含量均增加，說明輕度遮光有利于可溶性糖的積累。糖的積累，可誘導(dǎo)多種花色苷生物合成相關(guān)酶基因的表達(dá)[29]，為花色苷的形成提供能源和前體物質(zhì)[30]，進(jìn)而促進(jìn)花色苷合成。張超等[31]和程怡[32]認(rèn)為花瓣可溶性糖含量與花色苷含量呈正相關(guān)。本研究中，隨著花序的發(fā)育，花色苷含量和可溶性糖均呈先升后降趨勢，但可溶性糖含量峰值滯后，在舌狀花完全展開時(shí)可溶性糖含量達(dá)到最高，與菊花品種‘麗金’花序發(fā)育過程中還原糖含量的變化趨勢相同[33]?？赡苁蔷栈^狀花序開放的過程中，花序內(nèi)不同輪舌狀花處于不同的發(fā)育階段，花色苷的合成和降解同時(shí)存在，而不同輪舌狀花在發(fā)育過程中可溶性糖含量不斷積累，最終導(dǎo)致可溶性糖含量峰值滯后。

圖4 不同時(shí)期不同遮光處理對CmUFGT基因表達(dá)的影響Fig.4 The effect of shading at different stages on the expression of CmUFGT in each stage

光是影響花色苷積累的重要環(huán)境因子，在大多數(shù)植物組織細(xì)胞中花色苷的合成受光調(diào)節(jié)，強(qiáng)光有利于花色苷的合成[34]。菊花花發(fā)育早期是感受光誘導(dǎo)的關(guān)鍵階段[33]。本研究中‘紫重樓’花發(fā)育第3、4階段，光照越強(qiáng)花色苷含量越高；第7、8階段，光照越強(qiáng)花色苷含量越低。表明花序發(fā)育中期強(qiáng)光照有利于花色苷的合成，花序發(fā)育后期弱光有利于緩解花色苷的降解。Fukuoka N等[35]認(rèn)為夏季高溫導(dǎo)致紫背天葵葉花色苷含量降低。胡可[11]認(rèn)為高溫導(dǎo)致菊花花色苷降解。本研究中，‘紫重樓’花序發(fā)育后期，遮光延緩了花色苷的降解，是由于遮光降低了花序生長微環(huán)境中的氣溫，進(jìn)而降低了花色苷降解酶的活性，同時(shí)降低了呼吸作用，減少了碳水化合物的消耗，延緩了花色苷降解。遮光不能完全抑制花色苷的降解，只能延緩其降解，說明在花開放的過程中，花色苷降解是不可避免的，植物體自身生理生化發(fā)生變化導(dǎo)致花色苷含量減少，是植物體的一種調(diào)節(jié)機(jī)制?；ㄉ帐侵参矬w內(nèi)重要的次生代謝物，具有很高的生物活性，花色苷極可能降解成其他有利于植物生長或參與其它代謝的物質(zhì)。

綜上所述，地被菊開花過程中，花序不同發(fā)育期遮光處理顯著或極顯著影響CmUFGT基因表達(dá)；輕度遮光(L1)促進(jìn)可溶性糖含量增加，花序干重比增加；花發(fā)育中期(第3、4階段)輕度遮光(L1)有利于花色苷的合成，花發(fā)育后期(第7、8階段)重度遮光(L3)有利于緩解花色苷的降解。