王朋朋, 徐 佳, 張麗梅, 張淑華, 王麗萍,

(1. 長春理工大學 生命科學技術(shù)學院, 長春 130022; 2. 吉林大學 生命科學學院, 長春 130012；3. 新時代健康產(chǎn)業(yè)(集團)有限公司, 北京 102206)

藥食同源[1]植物指既可食用又可藥用的植物. 刺梨(Rosaroxburghii)、干姜(Zingiberoj-jicinaleRosc.)、肉桂(CinnamomumcassiaPresl)、山藥(Dioscoreaerhizoma)和葡萄籽(grape seed)均為藥食同源植物. 刺梨鮮果含鈣、鐵、碘、鋅和硒等多種微量元素及與豐富的營養(yǎng)物質(zhì), 并含有多超氧化物歧化酶(SOD)和總黃酮[2]等活性成分, 具有抗輻射、消炎、抗癌等功效. 干姜主要含有姜辣素類、揮發(fā)油類、二苯基庚烷類等化學活性成分及少量的糖苷類、黃酮類、氨基酸、多種維生素等[3], 具有抑菌消炎、降脂降糖[4-5]、抗腫瘤[6]等功效. 肉桂主要含有肉桂精油、黃酮類、油樹脂、多糖、多酚等生理活性物質(zhì)[7], 具有消炎、降糖、抗腫瘤[8]等功效. 山藥含有蛋白質(zhì)、3,4-二羥基苯乙胺、維生素、植酸、膽堿、多巴胺、山藥堿等有效成分, 具有抗衰老、降糖降脂、抑腫瘤等功效[9]. 葡萄籽是葡萄的種子, 含有豐富的氨基酸、維生素、多酚類及礦物質(zhì)[10], 具有抗衰老、抗氧化[11]、抗腫瘤[12]等功效. 本文以典型抗氧化實驗動物----秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans, 線蟲)為模式生物, 以5種藥食同源植物刺梨、干姜、肉桂、山藥、葡萄籽為原料, 采用水提法獲得各自有效成分, 通過對受試C.elegans的壽命實驗、體外氧化壓力實驗及C.elegans體內(nèi)自由基的測定, 綜合評估5種藥食同源植物的抗氧化作用.

1 材料和方法

1.1 儀器材料與試劑

電子分析天平(sartorius BT25S型, 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)； 數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4型, 上海比朗儀器有限公司)； 高壓滅菌鍋(MLS-3750型, 松下健康醫(yī)療器械(上海)有限公司)； 高速低溫離心機(Centrifuge 5810R型, 德國Eppendorf公司)； 鼓風干燥箱(GZX-9070 MBE型, 上海博迅實業(yè)有限公司)； 超聲波細胞破碎儀(JY96-IIN型, 寧波新芝生物科技股份有限公司)； 凍干機(ALPHA 1-4 LD plus型, 德國CHRIST公司)； 生化培養(yǎng)箱(SPL-80型, 天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司)； 超凈工作臺(SW-CJ-1FD型, 江蘇蘇州凈化設(shè)備有限公司)； 體視顯微鏡(XTL-24型, 上海普丹光學儀器有限公司)； 熒光酶標儀(FLX-800型, 美國BioTek有限公司)等.

野生型秀麗隱桿線蟲(Bristol N2)、缺陷型大腸桿菌(EscherichiacoliOP50)均購于美國Caenorhabditis Genetics Center； 刺梨、干姜、肉桂、山藥和葡萄籽原材料均由北京新時代健康產(chǎn)業(yè)(集團)有限公司提供; 胰蛋白胨、酵母抽提物均購于英國OXOID公司； 瓊脂粉、膽固醇購于上海生工生物工程股份有限公司； 二氯熒光黃(DCF)購于上海試劑二廠； 其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純試劑.

1.2 方 法

1.2.1 水提物制備 分別稱取一定質(zhì)量的刺梨、干姜、肉桂、山藥和葡萄籽, 剪刀剪碎, 研磨成粉, 在60 ℃下烘干后, 分別稱取20 g粉末溶于200 mL雙蒸水中, 置于超聲細胞粉碎儀中, 于40 ℃, 100 Hz超聲40 min后， 轉(zhuǎn)置恒溫培養(yǎng)箱于37 ℃, 200 r/min恒溫震蕩48 h. 離心(4 ℃, 4 000 r/min , 8 min)后取上清液, 再次離心(4 ℃, 8 000 r/min， 30 min), 取其上清液； 于凍干機中凍干后備用.

使用培養(yǎng)至對數(shù)生長期的OP50大腸桿菌菌液分別稀釋5種水提物凍干粉, 至終質(zhì)量濃度分別為0.5,1,2 mg/mL, 實驗過程中現(xiàn)用現(xiàn)配； 不添加凍干粉的OP50大腸桿菌菌液作為對照.

1.2.2 線蟲的培養(yǎng) 線蟲生長培養(yǎng)基(NGM)： 每配制100 mL NGM培養(yǎng)基需稱取0.30 g NaCl, 1.70 g瓊脂, 0.25 g蛋白胨, 5 mg/mL膽固醇乙醇溶液100 μL, 經(jīng)高壓蒸汽滅菌后, 室溫冷卻至約55 ℃, 分別加入100 μL無菌的1 mol/L CaCl2、1 mol/L MgSO4及1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS Buffer, pH=7.0)2.5 mL. 用無菌操作方法, 鋪平板于一次性塑料平皿. 待培養(yǎng)基冷凝后, 在NGM固體培養(yǎng)基表面涂布OP50菌液(空白組)、植物水提物混合OP50菌液(實驗組), 于20 ℃過夜培養(yǎng)后備用.

1.2.3 線蟲壽命的測定 參考文獻[13], 分別挑取同期化處理后的L4期線蟲, 各移至涂有大腸桿菌OP50的NGM平板上進行培養(yǎng), 產(chǎn)卵時開始計時為0 d, 每隔1 d將線蟲移至相同的新NGM平板上觀察, 統(tǒng)計線蟲死亡情況, 直到受試線蟲全部死亡為止(每組統(tǒng)計50只線蟲). 以對刺激完全沒有反應即認定線蟲死亡. 在統(tǒng)計線蟲死亡情況時, 不統(tǒng)計丟失的線蟲和蟲袋數(shù)據(jù). 實驗過程中, 受試線蟲在生長至L4期分別進行給藥, 各組給藥的質(zhì)量濃度均為2 mg/mL.

1.2.4 線蟲體外氧化壓力測定實驗 隨機選取10只同期化的L4期線蟲轉(zhuǎn)移至各給藥組, 平板20 ℃培養(yǎng)3 d后, 轉(zhuǎn)移至含有10 mmol/L過氧化氫的NGM培養(yǎng)基平皿中, 錫紙密封避光, 20 ℃恒溫保存. 每小時觀察并統(tǒng)計線蟲的存活數(shù)量. 實驗重復3次作為平行實驗.

1.2.5 線蟲體內(nèi)自由基測定實驗 參考文獻[14], 采用二氯熒光黃(DCF)對受試線蟲體內(nèi)的活性氧自由基進行測定. 隨機選取100只處于L4期的線蟲(均經(jīng)同期化處理)移至各給藥組, 平板20 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d后, 分別轉(zhuǎn)移至含有10 mmol/L過氧化氫的NGM液體培養(yǎng)基平皿中, 錫紙密封避光, 于20 ℃恒溫處理1 h后, 將各組線蟲先后用清水和NGM培養(yǎng)基各浸泡2遍, 每遍10 min, 之后移至96孔板中. 每孔分別加入50 μL NGM液體培養(yǎng)基和50 μL DCF, 將96孔板用錫紙包好避光, 于20 ℃, 130 r/min振蕩培養(yǎng)1 h. 使用熒光酶標儀檢測各受試組線蟲體內(nèi)活性氧自由基含量, 激發(fā)波長為485 nm, 阻斷波長為528 nm. 實驗重復3次作為平行實驗.

1.3 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計

線蟲壽命測定的數(shù)據(jù)采用Prism GraphPad5軟件進行統(tǒng)計分析, 線蟲存活的生長曲線采用Kaplan-Meier方法生成. 用Log-rank (Mantel-Cox) Test軟件進行顯著性檢驗. 當P<0.05*時表示具有顯著性差異; 當P<0.01**時表示具有非常顯著性差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 線蟲壽命的測定結(jié)果

對線蟲壽命進行測定可直觀評價線蟲處于何種生理狀態(tài), 是對外界藥物進行評估的重要參考指標之一. 外界藥物可通過改變受試線蟲的代謝速率、抗熱激能力、抗氧化能力以及脂肪積累等調(diào)節(jié)線蟲壽命[15]. 用Log-rank (Mantel-Cox) Test進行分析計算, 刺梨、葡萄籽、干姜、肉桂、山藥水提物對線蟲壽命的影響如圖1所示. 由圖1可見, 與對照組相比, 2 mg/mL的刺梨和葡萄籽水提物能非常顯著延長受試線蟲壽命(P<0.01), 干姜、肉桂和山藥水提物對受試線蟲壽命影響不明顯(P>0.05).

圖1 刺梨、葡萄籽水提物(A)和干姜、肉桂、山藥水提物(B)對線蟲壽命的影響Fig.1 Effects of R.roxburghii, grape seeds water extractions (A) and Z.oj-jicinale, C.cassia, D.rhizoma water extractions (B) on lifespan of C.elegans

2.2 線蟲體外氧化壓力測定結(jié)果

體外氧化壓力實驗可通過過氧化氫、百草枯等物質(zhì)誘導產(chǎn)生氧化壓力[16]. 本文采用10 mmol/L過氧化氫分別對各組受試線蟲進行處理, 即通過外界氧化壓力的作用, 啟動線蟲本身的應激性抵抗反應功能, 在一定程度上可提升線蟲的耐受能力, 但超過一定限度即導致氧化損傷. 采用5種植物提取物對線蟲進行給藥保護, 結(jié)果如圖2所示. 由圖2可見, 與對照組相比, 3種質(zhì)量濃度(0.5,1,2 mg/mL)的5種植物水提物對受試線蟲作用后, 均呈非常顯著性差異(P<0.01). 表明在10 mmol/L過氧化氫誘導的體外氧化壓力下, 5種不同種類、不同質(zhì)量濃度的植物水提物均對受試線蟲具有很強的氧化損傷修復能力, 且總體呈劑量-效應關(guān)系.

2.3 線蟲體內(nèi)自由基測定結(jié)果

自由基與生物氧化作用關(guān)系密切, 正常的生物機體需保持一定的自由基水平, 即生物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除需維持一種動態(tài)變化的平衡關(guān)系. 若外界環(huán)境或外源物質(zhì)對生物機體產(chǎn)生氧化壓力, 則生物體內(nèi)自由基的生成水平明顯提高, 打破平衡狀態(tài), 導致生物體的氧化應激[17], 最終對生物體造成損害. DCF進入受試線蟲體內(nèi)后會被酯酶水解, 去乙?；笮纬啥葻晒恻S雙乙酸(DCFH), DCFH可與細胞內(nèi)自由基作用, 生成有熒光的產(chǎn)物, 在480～520 nm條件下產(chǎn)生熒光, 熒光強度與自由基數(shù)量呈正相關(guān). 先用10 mmol/L過氧化氫分別對各組受試線蟲進行處理后, 自由基水平均顯著增加, 再用5種植物提取物進行給藥保護, 結(jié)果如圖3所示.

圖2 刺梨、干姜、肉桂、山藥、葡萄籽水提物對氧化壓力下線蟲的保護作用Fig.2 Protective effects of R.roxburghii, Z.oj-jicinale, C.cassia, D.rhizoma, grape seeds water extractions on C.elegans under oxidative stress

圖3 刺梨、干姜、肉桂、山藥、葡萄籽水提物對受試線蟲體內(nèi)自由基的清除能力Fig.3 Free radical scavenging abilities of R.roxburghii, Z.oj-jicinale, C.cassia, D.rhizoma, grape seeds water extractions on tested C.elegans

由圖3可見, 與對照組相比, 0.5,1,2 mg/mL的5種植物水提物均對受試線蟲體內(nèi)的自由基具有一定的清理能力, 且符合劑量-效應關(guān)系. 其中1 mg/mL的刺梨水提物和1 mg/mL的葡萄籽水提物與對照組相比具有顯著差異； 2 mg/mL的刺梨水提物和2 mg/mL的葡萄籽水提物與對照組相比具有非常顯著差異. 表明刺梨和葡萄籽清除受試線蟲體內(nèi)自由基的效果較好， 其他3種植物水提物的效果一般.

綜上所述, 本文以秀麗隱桿線蟲為模式動物, 通過壽命測定實驗、體外氧化壓力測定實驗和體內(nèi)自由基測定實驗綜合評價刺梨、干姜、肉桂、山藥、葡萄籽5種藥食同源植物的抗氧化效果. 實驗結(jié)果表明： 2 mg/mL的刺梨和葡萄籽水提物均能非常顯著延長受試線蟲壽命； 5種不同質(zhì)量濃度植物的水提物均對受試線蟲具有顯著的氧化損傷修復能力和抗氧化能力； 不同質(zhì)量濃度的5種植物水提物均對受試線蟲具有一定的清除體內(nèi)自由基能力, 其中刺梨和葡萄籽清除自由基效果顯著.