張奇 曹英昆 邢澤宇 梁艷 沈慶洲

摘要：通過對小球藻（Chlorella vlgaris）在不同環(huán)境因素pH和鹽度條件下，藻液溶氧量和生長量的測定，初步確定小球藻對鹽度具有廣適性，在0～45的鹽度海水中都能生長，其中在鹽度為25時溶氧量和生長量達最大，分別為7.65 mg/L和2.65×107個/mL，小球藻在pH為5.5～11.5的環(huán)境中可以生存，在pH為9.0時溶氧量和生長量達到最高，分別為8.04 mg/L和2.5×107個/mL，在pH大于11.0時小球藻生長明顯減慢，甚至出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

關鍵詞：小球藻（Chlorella vlgaris）；pH；鹽度；生長量；溶氧量

中圖分類號：Q948.8 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）11-0083-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.11.020

Abstract： Based on the use of Chlorella vlgaris in different environmental factors pH and salinity conditions，determination of dissolved oxygen and liquid algae growth， preliminary determination of Chlorella vlgaris has wide adaptability to salinity， growth in 0 to 45 in the salinity of sea water can， in which salinity 25 of the dissolved oxygen and the largest amount of growth to the largest data，the highest value of dissolved oxygen content and growth were 7.65 mg/L and 2.65×107/mL， Chlorella vlgaris at pH 5.5～11.5 environment can survive at pH 9 dissolved oxygen and growth of most high the highest the data here， the highest value of dissolved oxygen content and growth were 8.04 mg/L and 2.5×107/mL， the pH is greater than chlorella growth slowed significantly in 11， and even the phenomenon of death.

Key words： Chlorella vlgaris；pH；salinity；growth；dissolved oxygen

小球藻（Chlorella vlgaris）是一種單細胞藻類，分類學上屬于綠藻門（Chlorophyta）、綠藻綱（Chlorophyce-ae）、綠球藻目（Chlorococcales）、小球藻科（Chlor-elaceae）、小球藻屬（ChlorelaBeijerinck）[1]。小球藻是微藻的一類，它的直徑在3～8 μm。以光合自養(yǎng)生長繁殖，是一種高效的光合植物，分布范圍極廣，可以在地球上許多地方生存。現(xiàn)在已知約有15種小球藻，其變種可達百種。中國常見的有普通小球藻（Chlorellavlgaris）、橢圓小球藻（Chellipsoidea）和蛋白核小球藻（Chpy-renoidosa）[2]，適宜在人工條件下培養(yǎng)繁殖，規(guī)模化、工廠化生產(chǎn)已經(jīng)實現(xiàn)[3，4]。小球藻含有豐富的營養(yǎng)，富含蛋白質(zhì)、脂肪和維生素等多種營養(yǎng)物質(zhì)，具有很高的開發(fā)價值，已經(jīng)應用于多方面，如食品方面有保健食品、食品添加劑，工業(yè)方面已開發(fā)生物柴油、化工產(chǎn)品等。近年來，微藻開發(fā)利用技術發(fā)展迅速[4-8]。pH是影響微藻生長的重要因子之一。微藻細胞內(nèi)有關酶的活性和結構與pH密切相關，pH可以改變水體中有機物的狀態(tài)和金屬復合物的溶解性，對微藻細胞生長和代謝活動產(chǎn)生重要影響[9-12]。藻類是水體中的生產(chǎn)者，進行光合作用吸收CO2和呼吸作用釋放CO2，改變水體中的酸堿性，從而影響培養(yǎng)環(huán)境中的pH[13]，所以在觀測藻類生長速率時，pH是一個重要的指標[14]。大量研究表明，微藻的生長和光合作用與pH密切相關，不同種類的微藻適應生存的pH各不相同[8，15-17]。

為了更加充分利用小球藻，首先要提高小球藻的生產(chǎn)力，增加小球藻的成活率與產(chǎn)量。藻類本身的生理特點以及藻類生長與諸多環(huán)境因素有關，其中影響藻類生長的重要環(huán)境因素有水體溫度、鹽度、pH、光照等。對于小球藻的研究，國內(nèi)外主要集中在一些化學元素以及光合作用等方面。楊桂娟等[18]研究指出小球藻生長量與溶氧量在25 ℃時增長率達到最大。杜宇等[19]提出小球藻在鹽度較低的生長環(huán)境中生長速度較快，較高鹽度時不適宜生長。Rai等[20]研究表明，酸性pH會抑制小球藻的生長、細胞內(nèi)硝酸還原酶的活性以及對NO3-、NH4+的吸收。Zhang等[21]、張虎等[22]研究指出小球藻的油脂含量在適宜的溫度、鹽度和pH條件下有所提高。在前人的基礎上，本試驗利用測定溶液中的溶氧、懸濁液濃度的方法，研究pH和鹽度對小球藻生長量和溶氧量的影響，以期了解其特性，研究最佳小球藻生長pH和鹽度環(huán)境，為優(yōu)化培養(yǎng)條件提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藻種

小球藻：采用河北農(nóng)業(yè)大學渤海校區(qū)藻種室提供保種于f/2液體培養(yǎng)基的小球藻。

1.2 培養(yǎng)基

采用海水（人工海水）小球藻所用的f/2液體培養(yǎng)基，各組分濃度如表1所示。

1.3 培養(yǎng)條件

經(jīng)長時間保存的小球藻活力會降低，為提高小球藻活力，試驗開始前先進行小球藻活化培養(yǎng)?；罨囵B(yǎng)方法是將小球藻接種到培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d，每天搖晃培養(yǎng)瓶5～8次，以防小球藻下降附著于瓶壁。在25 ℃下培養(yǎng)，光暗周期為14 h∶10 h，用1 L三角瓶培養(yǎng)小球藻，每瓶放藻液1 000 mL。

將進入對數(shù)期的藻種轉(zhuǎn)移到洗凈后的250 mL錐形瓶，每只錐形瓶接入100 mL小球藻液。將接入小球藻液的錐形瓶放置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，其間不換培養(yǎng)液。藻液鹽度和pH分別用NaCl和NaOH（0.5 mol/L）以及HCl（0.5 mol/L）調(diào)節(jié)，為防止藻液pH改變，每隔6 h測定一次并校正，以保證藻液pH在整個試驗過程中變化不超過±0.2。轉(zhuǎn)動錐形瓶的位置以使小球藻受到的光照均勻。試驗過程中，嚴格按照無菌操作。

1.4 小球藻生長量的測定

吸取定量培養(yǎng)的小球藻藻液于血球計數(shù)板，在顯微鏡下計數(shù)小球藻數(shù)量，通過小球藻數(shù)量變化來觀測小球藻生長量情況。

1.5 藻液溶氧量的測定

采用組裝溶解氧測定系統(tǒng)測定藻液溶解氧濃度的變化，該溶解氧測定系統(tǒng)由具有溫度自動補償功能的STARTER300D便攜式溶解氧測定儀、磁力攪拌器組成。讀取溶解氧測定儀上的讀數(shù)，即溶解氧濃度DO（mg/L），計算單位時間內(nèi)溶氧值，取3個相對穩(wěn)定數(shù)據(jù)，求平均值。

1.6 不同鹽度條件下溶氧量和生長量的測定

設定光照度為7 500 lx、溫度為25.0 ℃、pH為7.00±0.05的條件下，測定小球藻的溶氧量和生長量，取對數(shù)生長期的小球藻藻液分別加入250 mL的無菌三角瓶中（100 mL藻液/瓶） ，共30瓶，分為10組，每組3次重復，加入NaCl，將10組藻液的鹽度分別調(diào)為鹽度梯度：0、5、10、15、20、25、30、35、40、45。培養(yǎng)12 h后，每4 h測定不同鹽度條件下小球藻的溶氧量和生長量。

1.7 不同pH條件下溶氧量和生長量的測定

設定光照度為7 500 lx、溫度為25.0 ℃的條件下[18]，測定小球藻的溶氧量和生長量。取對數(shù)生長期的小球藻藻液，向滅菌的250 mL三角瓶中放入100 mL藻液，共30瓶，分為10組，每組3個重復，用NaOH和HCl將每組藻液pH分別調(diào)至5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0、10.0、10.5、11.0、11.5。在弱光環(huán)境中放置12 h，每隔6 h用NaOH和HCl調(diào)節(jié)藻液的pH，測定前再一次將藻液調(diào)為設定的pH。

2 結果與分析

2.1 鹽度對小球藻藻液溶氧量的影響

對小球藻藻液進行不同鹽度處理，每隔4 h測定其溶解氧量。鹽度對小球藻藻液溶氧量的影響如圖1所示，小球藻溶液溶氧量在0～45鹽度范圍內(nèi)均有不同程度的變化。但鹽度在25，時間為12 h時溶氧量達到最高值為7.65 mg/L，在同一鹽度下比較3個不同時間點溶解氧都有不同程度增加，不同鹽度下的增加程度各不相同。鹽度在25左右時，小球藻藻液溶氧量較高，小球藻較適宜生長。

2.2 鹽度對小球藻藻液生長量的影響

對小球藻藻液進行不同鹽度處理，每隔4 h測定其濃度（小球藻生長量是以其濃度來表示），鹽度對小球藻生長量的影響如圖2所示，小球藻藻液在0～45鹽度范圍內(nèi)均有不同程度的變化。鹽度在25，時間為12 h時濃度達到最高值，為2.65×107個/mL，同時在同一鹽度下比較3個不同時間點藻液濃度都有不同程度增加，不同鹽度下的增加程度各不相同。鹽度在25時小球藻藻液濃度較高，小球藻較適宜生長。

小球藻藻液在0～45鹽度范圍內(nèi)溶氧量和生長量均有不同程度的增長，其中鹽度在25時達到最高，溶氧量和生長量的最高值分別為7.65 mg/L和2.65×107個/mL，分析結果表明，小球藻在鹽度為25時的溶氧量和生長量與其他各鹽度下溶氧量和生長量之間均存在顯著差異（P<0.05） ，這說明該小球藻生長的較適鹽度為25。

2.3 pH對小球藻藻液溶氧量的影響

對小球藻藻液進行不同pH處理，每隔4 h測定其溶解氧量，pH對小球藻藻液溶氧量的影響如圖3所示。小球藻溶液溶氧量在pH為5.5～11.5范圍內(nèi)均有不同程度的變化。pH在9.0，時間為12 h時溶氧量達到最高值，為8.04 mg/L，在同一pH下比較3個不同時間點溶氧量都有不同程度增加，不同pH下的增加程度各不相同。pH在9.0時小球藻藻液溶氧量較高，小球藻較適宜生長。

2.4 pH對小球藻藻液生長量的影響

將小球藻藻液以不同的pH處理，每隔4 h測定其濃度（小球藻生長量是以其濃度來表示），pH對小球藻生長量的影響如圖4所示。小球藻藻液在pH為5.5～11.5均有不同程度的變化。pH在9.0，時間為12 h時濃度達到最高值，為2.5×107個/mL，同一pH下比較3個不同時間點藻液濃度都有不同程度增加，不同pH下的增加程度各不相同。pH在9.0時小球藻藻液濃度較高，小球藻較適宜生長。

小球藻藻液pH在5.5～11.5溶氧量和生長量均有不同程度的變化，其中pH在9.0時達到最高，溶氧量和生長量的最高值，分別為8.04 mg/L和2.5×107個/mL，分析結果表明，小球藻在pH為9.0時的溶氧量和生長量與其他各pH下溶氧量和生長量之間均存在顯著差異（P<0.05），這說明該小球藻生長的較適pH為9.0。

3 討論與結論

3.1 鹽度對小球藻生長的影響

鹽度通過改變微藻細胞內(nèi)外的滲透壓，對微藻葉綠素含量、光合作用和代謝產(chǎn)生一定作用[23]。本試驗分析了鹽度對小球藻藻液在溶氧量和生長量方面的影響。Jin[24]提出單細胞藻類生長在鹽度作用下呈拋物線，過低或過高的鹽度都會影響藻類生長。劉加慧等[25]指出鹽度在15～30時小球藻生長速率呈上升趨勢，在30～45時生長速率呈下降趨勢，與本研究結果相似。朱曉艷等[26]提出小球藻在較低鹽度下適宜生長，在高鹽度下抑制生長。本試驗表明，在0～45鹽度溶氧量和生長量均有不同程度的增長，從低鹽度到高鹽度，小球藻溶氧量和生長量呈拋物線變化，其中鹽度在25時達到最高，表明小球藻較適宜生長。

3.2 pH對小球藻生長的影響

pH是影響微藻生長的重要因子之一。本研究通過探究pH對小球藻藻液在溶氧量和生長量方面的影響來研究pH對小球藻生長的影響。劉加慧等[25]研究指出pH對小球藻有顯著影響，朱曉艷等[26]研究表明小球藻在pH為8的條件下凈光合放氧速率最大，適合在弱堿環(huán)境中生長，與本研究結果相符。這些研究結果都表明小球藻適宜生長在弱堿環(huán)境中。試驗表明，pH在5.5～11.5的范圍內(nèi)溶氧量和生長量均有不同程度的變化，pH從低到高，小球藻溶氧量和生長量呈拋物線變化，其中pH在9.0時達到最高，表明小球藻較適宜在弱堿環(huán)境中生長。

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