譚擁軍 郭明月 向勤 李諭

摘 要：為了實現(xiàn)FOXP2基因在MCF-7細胞中穩(wěn)定低表達，采用基因工程的方法構(gòu)建pMAGic7.1-shFOXP2慢病毒干擾載體，并將其與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，包裝shFOXP2干擾慢病毒，收取病毒上清加入到MCF-7細胞中，培養(yǎng)48 h，熒光定量PCR檢測FOXP2的基因mRNA表達水平，Western Blotting檢測FOXP2蛋白表達水平.獲得了pMAGic7.1-shFOXP2干擾載體，從而成功建立FOXP2基因穩(wěn)定干擾的MCF-7細胞株，為進一步研究FOXP2在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的功能提供了研究材料.

關(guān)鍵詞：FOXP2；慢病毒載體；RNA干擾；乳腺癌MCF-7細胞

中圖分類號：U44文獻標志碼：A

Abstract：In order to establish a MCF-7 cell line with lentivirus-mediated FOXP2 gene silencing and confirm its interference effect， the lentiviral vector （pMAGic7.1-shFOXP2） was constructed by genetic engineering and cotransfected with pVSVG、Δ8.91 into HEK293T cells， which generated the mature lentivirus， viral supernatant was collected and added to MCF-7 cells after 48 h， the mRNA and protein levels of FOXP2 were examined by qPCR and Western blot. Thus， we constructed and identified the lentiviral recombinant vector pMAGic7.1-FOXP2，successfully established a MCF-7 cell line with the interference of FOXP2 expression， as these findings imply a promising strategy for studying FOXP2 functions in breast cancer progression.

Key words：the forkhead box p2； lentivirus vector； RNA interference； breast cancer MCF-7 cells

FOXP2基因位于7號染色體短臂31區(qū)域，屬于FOX轉(zhuǎn)錄家族.叉頭框蛋白（forkhead box）家族是一類具有廣泛功能的轉(zhuǎn)錄因子家族，它的DNA結(jié)合區(qū)是一個特殊的翼狀結(jié)構(gòu)，即螺旋轉(zhuǎn)角螺旋蛋白結(jié)構(gòu)，并且在生物進化中高度保守，此結(jié)構(gòu)由100個氨基酸組成，包含3個α螺旋、3個β折疊以及2個大環(huán)結(jié)構(gòu)[1].FOXP2蛋白包含一個谷氨酸富集區(qū)、一個FOX叉頭框DNA結(jié)合區(qū)和一個由50個氨基酸組成的高度保守的N端，在N端能夠形成鋅指或亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)是FOXP2與FOXP1 和 FOXP4 相互作用形成同源二聚化與異源二聚化所必需的 [2-3].FOXP2轉(zhuǎn)錄后可剪切形成18種轉(zhuǎn)錄本，經(jīng)過生物信息學(xué)和蛋白結(jié)構(gòu)分析，預(yù)測出FOXP2下游靶基因結(jié)合基序5-CAAATT-3[4].FOXP2主要在胚胎發(fā)育、細胞分化和腫瘤的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要的功能.

FOXP2（forkhead box p2）最早發(fā)現(xiàn)與控制語言能力發(fā)展相關(guān)，通過研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP2第553位的精氨酸突變?yōu)榻M氨酸（R553H）能夠引發(fā)嚴峻的先天性語言障礙疾病，并且FOXP2 的缺失或者突變可能引發(fā)語言障礙及運動神經(jīng)元系統(tǒng)紊亂[5-6].除此之外FOXP2在多種腫瘤細胞中表達與腫瘤的EMT發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系，大量研究數(shù)據(jù)已經(jīng)表明在骨肉瘤[7-9]、肝癌[10-12]、胃癌[13-14]可以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展.Dung-Tsa[15]等發(fā)現(xiàn)FOXP2基因及蛋白存在于人的正常組織和乳腺癌組織中，并在具有侵染性的乳腺中的表達被抑制，但對于FOXP2如何調(diào)控乳腺癌發(fā)生發(fā)展的機制研究尚不清楚.因此，研究乳腺癌細胞中FOXP2轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)EMT相關(guān)基因的分子機制，對認識乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移并確認抑制靶點具有重大價值.

對于細胞轉(zhuǎn)染有多種方法，包括脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、磷酸鈣轉(zhuǎn)染、腺病毒感染和慢病毒感染，相比其它轉(zhuǎn)染方法而言，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和磷酸鈣轉(zhuǎn)染最為常見，但其轉(zhuǎn)染效率會因細胞種類的不同而有所差異，并且脂質(zhì)體的成本較高.生物實驗中所用到的慢病毒載體大部分是以HIV為基礎(chǔ)、人為改造的基因治療載體，它的感染能力與細胞種類關(guān)系不大，感染的時候?qū)毎幍纳L時期沒有特別的要求.只需要將目的基因片段連接到慢病毒載體中，目的基因會隨著病毒基因的復(fù)制而復(fù)制，包裝成新的病毒感染宿主細胞，被整合到宿主細胞的基因組上.由于輔助質(zhì)粒不能被包裹于新的病毒內(nèi)，所以病毒包裝完成后，只具有感染細胞的能力，而不能在宿主細胞內(nèi)再次形成新病毒，不會使宿主細胞裂解死亡，提高了生物安全性，大大節(jié)約成本[16-17].

本文應(yīng)用慢病毒的方法構(gòu)建了FOXP2基因沉默的MCF-7穩(wěn)定表達細胞株，為以后乳腺癌的臨床治療提供良好的素材和工具.

1 材料和方法

1.1 細胞和材料

HEK293T細胞、乳腺癌MCF-7細胞本實驗室儲存；DH5α感受態(tài)細胞購于takara公司；慢病毒載體pMAGic7.1、pVSVG、Δ8.91均來自于上海生博醫(yī)學(xué)生物工程科技有限公司.

1.2 主要試劑和儀器

1Kb DNA Ladder marker、marker2均購自于廣東東盛科技公司；雙色蛋白預(yù)染蛋白marker購自生工生物工程上海有限公司；蛋白核酸分析儀來自于Eppendorf 公司；胰酶、DMEM培養(yǎng)基來自于GIBCO公司；FBS購自Hyclone公司；PVDF購自Millipore公司；PBS購自北京鼎國公司；過硫酸銨（APS）、十二烷基磺酸鈉（SDS）購自Sigma公司；FOXP2抗體購自cell signaling technology（CST）公司；Rabbit二抗購自GE公司.

1.3 方 法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

HEK 293T細胞和MCF-7細胞均用含10%的FBS和1%雙抗（含100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素）的DMEM完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，放置在37 ℃、5%濃度CO2、90%相對濕度的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，等細胞達到平臺期后進行傳代，當(dāng)HEK293T細胞密度達到80%可以進行磷酸鈣轉(zhuǎn)染.

1.3.2 干擾序列的獲取

查詢文獻[12]獲得FOXP2干擾序列，如表1.

1.3.3 pMAGic7.1-shFOXP2慢病毒載體的構(gòu)建

將合成的干擾序列用1×TE buffer溶解成20 μM，互補的單鏈各取30 μl混合，混合后的產(chǎn)物放入水浴鍋中95 ℃加熱5 min，然后將水浴鍋關(guān)閉，開蓋，在室內(nèi)自然冷卻，使干擾序列互補配對形成雙鏈，取1 μl做后面連接使用，剩余的-20 ℃儲存.經(jīng)AgeI/EcoRI雙酶切后對線性化的載體pMAGic進行膠回收，獲取酶切產(chǎn)物，取退火后雙鏈DNA序列1 μl，2.5 μl酶切后的干擾載體，10×T4 DNA ligase buffer 2 μl，T4 DNA ligase 1 μl，ddH2O 13.5 μl，21 ℃連接40 min.將2 μl酶連產(chǎn)物加入到20 μl的感受態(tài)細胞中，冰上靜置30 min，再將EP管迅速放入42 ℃水浴鍋中熱激90 s，冰上冷卻2 min，然后加入500 μl LB培養(yǎng)基，放入搖37 ℃，220 r/min活化細菌1 h，此后吸取適量的細菌轉(zhuǎn)化液進行涂板（含有Amp的LB固體培養(yǎng)板），在37 ℃細菌培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12～16 h.

1.3.4 shFOXP2慢病毒載體的鑒定

每個培養(yǎng)板分別挑取4個單克隆菌落進行菌落PCR鑒定，5通用引物5-AGCGGATCTGACGGTTCACT-3，3引物分別為Control 3AATTCAAAAAAAACACCGTTCGAGACACGATCT

CTTGAGTCGTGTCTCGAACGGTGTT；shFOXP2#2 3AATTCAAAAAAAACTTGGAAGAATGCAGTATCTCTTGAGTACTGCAT

TCTTCCAAGTT；shFOXP2#4 3AATTCAAAAAAAGCAAACAAGTGGATTGAATC

TCTTGAGTTCAATCCACTTGTTTGCT；用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測菌落PCR擴增后的產(chǎn)物，選取陽性克隆送入生工生物公司進行測序鑒定.

1.3.5 磷酸鈣轉(zhuǎn)染與shControl、shFOXP2慢病毒的包裝和感染

當(dāng)HEK293T的細胞密度達到80%左右，就可以進行轉(zhuǎn)染實驗，需加樣體系如下pMAGic-Control、pMAGic7.1-shFOXP2#2和pMAGic7.1-shFOXP2#4質(zhì)粒各12 μg，分別加入pVSVG質(zhì)粒6 μg，Δ8.91質(zhì)粒9 μg，2M CaCl2 132 μl，補水至1 ml；2×HBS 1 ml；將上述物質(zhì)進行混合，吹打70～100次，直到出現(xiàn)乳白色，在室溫靜置20 min后緩慢加入293T細胞中，8 h后進行細胞換液，換液前用1×PBS洗一遍，然后加入含有10%FBS的DMEM新鮮培養(yǎng)基.鈣轉(zhuǎn)48 h和96 h后分別收取培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用0.45 μm的過濾頭進行過濾，去除細胞碎片，獲得慢病毒溶液.選取生長狀態(tài)良好的MCF-7細胞，將對照病毒和shFOXP2慢病毒加入其中進行感染，培養(yǎng)48 h后換取新鮮培養(yǎng)基，觀察感染效果，進行擴大培養(yǎng).

1.3.6 MCF-7中shFOXP2干擾效果的鑒定

獲取MCF-7細胞，1×PBS洗兩遍，刮取細胞進入2 ml EP管中，4 ℃離心 1 000 r/min，5 min，加入合適體積的RIPA裂解液，按1∶100的比例加入蛋白酶抑制劑，冰上放置1 h，再12 000 r/min，4 ℃離心，15 min，上清即為所需的蛋白溶液，用蛋白核酸分析儀測量蛋白濃度，此后用Western Blotting實驗進行檢測.

2 結(jié) 果

2.1 pMAGic7.1-control、pMAGic7.1-shFOXP2#2和4慢病毒干擾載體的構(gòu)建和鑒定

插入干擾序列的片段較短，酶切結(jié)果不明顯，我們根據(jù)pMAGic7.1載體的基因序列，在5端位置設(shè)計引物，預(yù)測PCR結(jié)果為700 bp大小.首先挑選12個單菌落，進行菌落PCR后經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1，除了11號其余長度大小均為700 bp，無雜帶，從每組干擾轉(zhuǎn)化菌液中分別挑取兩對送去生工生物公司進行測序，經(jīng)對比測序結(jié)果表明目的基因已成功插入慢病毒載體.

2.2 慢病毒載體的包裝和感染

在慢病毒包裝和轉(zhuǎn)染之前，首先觀察HEK293T（圖2A）和MCF-7（圖2B）的細胞形態(tài)和生長狀態(tài).選取生長密度約80%左右的HEK293T細胞，再將pMAGic7.1-control、pMAGic7.1-shFOXP2#2和4載體分別和輔助質(zhì)粒pVSVG和Δ8.91共同轉(zhuǎn)染HEK293T細胞， 48 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)有綠色熒光，見圖3，說明所構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功并正常表達.選取生長狀態(tài)良好的MCF-7細胞，細胞形態(tài)如圖2B，將上述慢病毒溶液用0.45 μm的過濾頭進行過濾，除去細胞碎片，分別感染正常的MCF-7細胞，培養(yǎng)48h后換取新鮮的培養(yǎng)基，并在顯微鏡下觀察有綠色熒光的出現(xiàn)，見圖4，說明慢病毒感染成功.

2.3 shFOXP2慢病毒干擾載體表達產(chǎn)物的鑒定

收集上面三種MCF-7細胞株進行qPCR分析和Western blot檢測，見圖5，結(jié)果表明，F(xiàn)OXP2基因在mRNA水平較對照組顯著下降，在蛋白表達水平發(fā)現(xiàn)FOXP2的表達也有明顯下降，由此說明我們已成功得到了低表達FOXP2的MCF-7細胞株.

3 討 論

目前，在基因治療方面慢病毒的應(yīng)用比較廣泛，它相對于腺病毒而言，無論細胞是否處在分裂期都對其具有感染能力[18-19]，對一些不分化的細胞、干細胞和癌細胞與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染相比可以大大提高轉(zhuǎn)染效率，節(jié)約成本.普通質(zhì)粒介導(dǎo)的shRNA持續(xù)時間比較短，不能整合到宿主的基因組中，不利于后續(xù)實驗的進行，本實驗運用目的載體和輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染形成完整的病毒，此病毒在成功感染宿主細胞后，就會喪失感染其他的細胞的能力，促使目的基因在宿主細胞中能夠穩(wěn)定表達.Pfeifer等[20]利用慢病毒與RNAi相結(jié)合的技術(shù)，將shRNA導(dǎo)入小鼠的受精卵中，獲得特定基因敲出的轉(zhuǎn)基因小鼠，應(yīng)用于某種基因的功能性研究.

綠色熒光蛋白（GFP）最早是由下村修等人于1962年在水母中發(fā)現(xiàn)的，分子量為26 KD，含有238個氨基酸[21-22]，其基因所表達的蛋白質(zhì)，在藍色波長范圍的激發(fā)下，發(fā)出綠色螢光，可與目的基因構(gòu)于同一表達載體，在細胞內(nèi)進行合成時無需復(fù)雜的翻譯修飾就能成功表達.慢病毒干擾載體中的GFP基因在細胞中能夠隨著目的基因的表達而穩(wěn)定表達，易于在熒光顯微鏡下觀察，并且不影響目的基因的表達和功能，可以作為一種標記基因，示蹤腫瘤細胞中某種基因的位置及量的變化，Hoffman[23]曾經(jīng)利用GFP導(dǎo)入腫瘤細胞建立多種動物移植瘤模型，可以動態(tài)、直觀的觀察藥物對腫瘤的影響，為藥物評價和腫瘤基礎(chǔ)治療提供良好的腫瘤模型.本文中通過建立FOXP2基因沉默穩(wěn)定表達細胞株，使此細胞株在藥物篩選和腫瘤轉(zhuǎn)移示蹤中發(fā)揮重要作用，為探討FOXP2基因沉默后對腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制提供理論基礎(chǔ).因此，利用穩(wěn)定的MCF-7細胞株進行小動物活體實驗，并通過小動物成像系統(tǒng)持續(xù)、直觀的觀察乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移情況，為乳腺癌后期的個體化治療提供更為科學(xué)的依據(jù)和精確的預(yù)后評估.

綜上所述，我們運用基因工程的方法成功構(gòu)建了FOXP2基因沉默的慢病毒質(zhì)粒pMAGic7.1 -shFOXP2，并將其分別與輔助質(zhì)粒pVSVG和Δ8.91共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，取病毒上清成功感染了MCF-7細胞株，成功獲得了能穩(wěn)定干擾FOXP2表達的乳腺癌MCF-7細胞株，為后期研究FOXP2在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的功能提供了很好的研究材料.

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