祁金玉,劉波,高國平,高萌萌,尹大川,蔡立新

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院,遼寧 沈陽　110866 )

紅豆杉又名紫杉、赤柏松等,常綠喬木,全身是寶,地栽高達(dá)25 m,世界珍稀樹種,屬國家一級(jí)保護(hù)植物,是集觀賞和藥用于一身的珍貴樹種[1]。紅豆杉主要分布在北半球,約有11種,目前我國共有4種和1變種[2],即云南紅豆杉Taxusyunnanensis、西藏紅豆杉T.wallichiana、東北紅豆杉T.cuspidata、中國紅豆杉T.chinensis和南方紅豆杉T.mairei,除東北紅豆杉分布在東北外，其余均產(chǎn)秦嶺、淮河以南,多為星散分布。東北紅豆杉主要分布在吉林長白山和黑龍江一帶,遼寧東部山區(qū)有少量分布。

紅豆杉的主要藥用價(jià)值是它的提取物—紫杉醇[3]。然而，紅豆杉在世界范圍內(nèi)自然資源貧乏,且紫杉醇含量極低[4],大約5～6棵100 a生大樹中才能提取到1 g紫衫醇,可治療一個(gè)癌癥患者[5]。紅豆杉樹形美麗,果實(shí)成熟后紅綠相映令人陶醉,因此也廣泛應(yīng)用于水土保持及園藝觀賞。

由于天然紅豆杉資源極其有限,且為國家保護(hù)的珍稀樹種,所以人工種植紅豆杉成為提取紫杉醇的主要來源。近年來,隨著紅豆杉人工種植面積的擴(kuò)大,其病害逐年加重,其中紅豆杉幼苗期易發(fā)根腐病。該病病原菌侵染性強(qiáng),病害蔓延訊速,發(fā)生危害嚴(yán)重時(shí)可致紅豆杉幼苗枯死,造成重大經(jīng)濟(jì)損失,已成為制約紅豆杉人工種植的重要因素。研究該根腐病病原菌生物學(xué)特性,對(duì)于有效防治紅豆杉根腐病具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料東北紅豆杉，采自遼寧新民市農(nóng)戶的種植地,3 a生病株。

1.2方法

1.2.1病原菌分離培養(yǎng)取發(fā)病東北紅豆杉根部,自來水清洗干凈,在病、健相交處剪取2～3 mm組織。10%漂白粉(次氯酸鈣)溶液消毒(漂白粉溶液現(xiàn)用現(xiàn)配)3～5 min,移至PDA培養(yǎng)基上,倒置,25 ℃下培養(yǎng)；待菌落長出后挑取前緣菌絲,回接于PDA培養(yǎng)基上,25 ℃溫箱中培養(yǎng)；待菌落顏色變深后,無菌條件下鏡檢孢子。若僅有鐮刀菌的孢子,則說明已獲得了純培養(yǎng),否則,需繼續(xù)轉(zhuǎn)接純化,直至獲得純培養(yǎng)。

1.2.2病原菌鑒定及致病性檢驗(yàn)采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法進(jìn)行鑒定。對(duì)菌落形態(tài)進(jìn)行描述,并在顯微鏡下觀察測量菌絲及分生孢子形態(tài)及大小等,鑒定其種類[6-8]。采用CTAB法提取基因組DNA[9],以ITS1與ITS4作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。序列測定工作由大連寶生物工程有限公司完成。將測得的ITS序列用GenBank中的BLAST序列比對(duì)工具進(jìn)行目的序列比對(duì)[10-12]。

根據(jù)柯赫氏法則,將分離到的病原菌制成孢子懸浮液(10×10倍鏡下每視野20～30個(gè)孢子)接種在3 a生健康東北紅豆杉植株根部,每株接種100 mL,檢測菌株的致病能力及植株發(fā)病癥狀。從接種后發(fā)病的植株上再進(jìn)行病原菌分離,確定分離菌株的致病性。

1.2.3碳源對(duì)病原菌菌絲生長的影響以Crapek為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,不加碳源的培養(yǎng)基為對(duì)照,分別以等碳量的葡萄糖、蔗糖、木糖、淀粉、果糖、乳糖作為供試碳源,配成含不同碳源的培養(yǎng)基,用直徑0.5 cm的無菌打孔器切取病原菌菌落，接種在配制好的平板培養(yǎng)基中央，置于25 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng),每個(gè)處理5個(gè)重復(fù),5 d結(jié)束。采用生長速率法測量菌落直徑[6],觀察記錄菌落特征。

1.2.4氮源對(duì)病原菌菌絲生長的影響以Crapek為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別以等氮量的蛋白胨、草酸銨、氯化銨、L-谷氨酸、硝酸銨為供試氮源,配成含不同氮源的培養(yǎng)基,用直徑0.5 cm的無菌打孔器切取病原菌菌落，接種在配制好的平板培養(yǎng)基中央，并設(shè)置無氮培養(yǎng)基對(duì)照,培養(yǎng)方法同1.2.3。

1.2.5溫度對(duì)病原菌菌絲生長的影響用直徑0.5 cm的無菌打孔器切取病原菌菌落,接種在PDA培養(yǎng)基上,分別置于5,10,15,20,25,30,35 ℃的恒溫箱中培養(yǎng),方法同1.2.3 。

1.2.6pH值對(duì)病原菌菌絲生長的影響用HCl(1 mol/L),HCl(0.1 mol/L),NaOH(1 mol/L),NaOH (0.1 mol/L)分別配制pH值為5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5的PDA固體培養(yǎng)基,用直徑 0.5 cm的無菌打孔器切取病原菌菌落，接種在配制好的不同pH值的平板培養(yǎng)基中央，培養(yǎng)方法同1.2.3 。

1.2.7光照條件對(duì)病原菌菌絲生長的影響將直徑0.6 cm的菌餅置于PDA平板中央,設(shè)12 h日光燈光暗交替照射、燈光持續(xù)照射、完全黑暗3個(gè)處理,于25 ℃下培養(yǎng),培養(yǎng)方法同1.2.3 。

2　結(jié)果與分析

2.1病原菌的鑒定及致病性

2.1.1形態(tài)特征東北紅豆杉根腐病主要危害3～5 a生幼苗根部,短期內(nèi)引起苗木發(fā)病,最先表現(xiàn)為頂梢?guī)讉€(gè)針葉褪綠,隨著時(shí)間推移發(fā)黃,幾周后,枝梢枯黃增多,很快全株枯黃,這時(shí)仔細(xì)觀察可見頂芽已全部枯死,挖出幼苗的根系,可見小根全部枯死,手捻根部皮層腐爛極易脫落,并在皮層下可見大量白色絲狀物(圖1)。

A.發(fā)病癥狀;B.根部受害癥狀;C.分生孢子(a大型分生孢子;b小型小孢子)圖1　東北紅豆杉根腐病癥狀及病原菌孢子形態(tài)

培養(yǎng)基上菌落灰白色,稀絨狀,可見清晰圈帶。粘分生孢子座,乳突狀聚生,粘質(zhì)灰白色,于移植塊四周基質(zhì)上形成。該菌產(chǎn)生兩型孢子:大型分生飽子產(chǎn)于粘分生孢子座上或氣生菌絲單生瓶梗上,直或彎曲,多為不等邊紡錘形,中間1～5個(gè)橫隔,3隔居多,孢子無色,大小為(19.0～68.0)μm×(3.5～7.0)μm;小型分生孢子梗細(xì)長,分枝,孢子寬卵形,無色,有時(shí)有1個(gè)橫隔,大小為(8.0～10.0)μm × (6.0～10.0)μm (圖1)。

2.1.2分子生物學(xué)鑒定對(duì)菌株進(jìn)行rDNA ITS測序結(jié)果表明,擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為545bp(圖2)。

應(yīng)用以上測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行對(duì)比分析,從數(shù)據(jù)庫中比對(duì)到相似度99%的茄腐皮鐮孢菌Fusariumsolani,登錄號(hào)為Sequence ID:JX524022.1。

因此,在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上結(jié)合分子生物學(xué)檢測結(jié)果,可以確定東北紅豆杉苗木根腐病病原菌為茄腐皮鐮孢菌Fusariumsolani(Mart.)App.et Woll.，屬于子囊菌門的無性型。

圖2　東北紅豆杉根腐病病原菌DNA測序序列

2.1.3致病性檢驗(yàn)東北紅豆杉接種后發(fā)病初期根部無變化,葉片變黃,后期整株枯萎,根部腐爛。經(jīng)分離培養(yǎng)鑒定再次獲得茄腐皮鐮孢菌。證明茄腐皮鐮孢菌是東北紅豆杉根腐病的致病病原菌。

2.2病原菌的生物學(xué)特性

2.2.1碳源對(duì)病原菌菌絲生長的影響病原菌在不同碳源培養(yǎng)基上均能生長。在乳糖和淀粉上菌落稀疏，在其余碳源上菌絲生長旺盛、致密;在蔗糖上生長速度快,第5天菌落直徑(5.99±0.17)cm,平均生長速率為(1.08±0.08)cm/d，在葡萄糖培養(yǎng)基上菌絲生長相對(duì)較慢,5 d后菌落直徑為(5.22±0.10)cm,平均生長速率為(0.92±0.05)cm/d。病原菌在無碳對(duì)照培養(yǎng)基上也能微弱生長(表1)。

蔗糖、果糖培養(yǎng)基上菌落近圓形,蔗糖培養(yǎng)基上菌絲比其它碳源培養(yǎng)基上的菌絲粗壯,絮狀,結(jié)構(gòu)緊密。木糖培養(yǎng)基上菌落近圓形,白色,邊緣波狀,菌絲較細(xì),結(jié)構(gòu)較密。乳糖培養(yǎng)基上菌落呈輻射狀,淺白色,菌絲纖細(xì),結(jié)構(gòu)疏松。乳糖和蔗糖培養(yǎng)基上菌落稍呈淺藍(lán)色。淀粉、無碳的培養(yǎng)基上,菌落結(jié)構(gòu)最疏松,菌絲最纖細(xì)。

表1　不同碳源對(duì)茄腐皮鐮孢菌菌絲生長的影響

2.2.2氮源對(duì)病原菌菌絲生長的影響病原菌在不同氮源培養(yǎng)基上均能生長。在蛋白胨的培養(yǎng)基上菌落致密,菌絲生長旺盛,生長速度最快,第5天菌落直徑(6.66±0.09)cm,平均生長速率為(1.12±0.05)cm/d。在硝酸銨培養(yǎng)基上菌絲生長緩慢,5 d后菌落直徑僅為(2.34±0.10)cm,平均生長速率為(0.34±0.11)cm/d。在無氮對(duì)照培養(yǎng)基上也能微弱生長(表2)。

蛋白胨、L-谷氨酸培養(yǎng)基上菌落近圓形,近白色,蛋白胨培養(yǎng)基上菌絲比其它氮源培養(yǎng)基上的菌絲粗壯,絮狀,結(jié)構(gòu)緊密。草酸銨、氯化銨培養(yǎng)基上菌落紅褐色,邊緣波狀,菌絲較細(xì),結(jié)構(gòu)較密。氯化銨培養(yǎng)基上菌落形狀不規(guī)則。硝酸銨培養(yǎng)基上菌落呈輻射狀,淺白色,結(jié)構(gòu)致密,形狀不規(guī)則。無氮源培養(yǎng)基上,菌落結(jié)構(gòu)最疏松,菌絲最纖細(xì)。

表2　不同氮源對(duì)茄腐皮鐮孢菌菌絲生長的影響

2.2.3溫度對(duì)病原菌菌絲生長的影響病原菌在10～35 ℃均能生長,10～30 ℃菌絲生長速度隨溫度升高而加快。適宜生長溫度為20～35 ℃,30 ℃時(shí)菌絲生長速度最快,第5天菌落直徑達(dá)(5.82±0.09)cm,平均生長速率為(1.00±0.07)cm/d。35 ℃時(shí)生長速度下降,5 ℃時(shí)菌絲幾乎不生長(表3)。30 ℃時(shí),菌絲粗壯,菌落致密。10 ℃時(shí),菌絲纖細(xì),菌落稀疏。35 ℃時(shí),易感染雜菌。

表3　不同溫度對(duì)茄腐皮鐮孢菌菌絲生長的影響

2.2.4pH值對(duì)病原菌菌絲生長的影響病原菌在pH值為5.0～8.0的培養(yǎng)基上均能較好生長,菌絲生長均較致密,在pH值6.0時(shí)生長最好。在pH值大于7.0時(shí),菌絲顏色呈淺棕褐色,易受其它雜菌污染(表4)。

表4　不同pH值對(duì)茄腐皮鐮孢菌菌絲生長的影響

2.2.5光照對(duì)病原菌菌絲生長的影響鐮刀菌在不同光照條件下均能生長。在12∶12光暗交替條件下菌落致密,菌絲生長旺盛,第5天生長速度最快菌落直徑達(dá)(5.82±0.09)cm,平均生長速率為(1.00±0.07)cm/d。全黑暗條件下菌絲生長緩慢,5 d后菌落直徑僅為(3.66±0.11)cm,平均生長速率為(0.59±0.14)cm/d(表5)。

表5　不同光照對(duì)茄腐皮鐮孢菌菌絲生長的影響

3　結(jié)論與討論

紅豆杉根腐病病原菌為茄腐皮鐮孢菌Fusariumsolani(Mart.)App.et Woll.，屬于子囊菌門無性型。該病原菌對(duì)多種不同碳源和氮源均能利用,最適碳源、氮源分別為蔗糖、蛋白胨;適宜病原菌菌絲生長的溫度為20～35 ℃,30 ℃時(shí)達(dá)到最大生長量,屬于中高溫型菌種;較適宜病原菌菌絲生長的pH值為5.0～8.0,最適pH值為6.0,為喜偏酸環(huán)境的菌種;不同光照條件下病原菌菌絲均能良好生長,在12∶12光暗交替條件下生長最快并最好。

本研究中,適宜病原菌菌絲生長的溫度范圍與王勇[13]和賈延祥[14]的研究結(jié)果基本相同;但適宜病原菌菌絲生長的pH值與王勇有較大差別,王勇研究中最適pH值為6.0～8.0,中性條件下生長最好。本研究中病原菌菌絲在光暗交替條件下生長最好,與賈延祥小麥根腐病尖孢鐮刀菌研究結(jié)果相同，但其研究茄腐皮鐮孢菌在全光照條件下生長好，陳先中[15]等人對(duì)楊樹爛根病鐮刀菌的試驗(yàn)結(jié)果是不同光照條件生長速度無差異。這種不同是否與地域分布、菌株菌種和寄主有關(guān),還有待進(jìn)一步研究。