程旺開，呂丹丹

(1.蕪湖職業(yè)技術(shù)學院，安徽蕪湖 241000； 2.合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽合肥 230009)

中國是產(chǎn)竹大國，竹的種類、面積、蓄積量及竹筍、竹材的產(chǎn)量均位居世界首位[1]，在竹筍加工過程中及竹筍成竹后都會產(chǎn)生大量的筍殼，未經(jīng)處理堆放于野外，腐爛后會產(chǎn)生惡臭，嚴重影響周邊農(nóng)林植被的生長并污染城鄉(xiāng)環(huán)境[2-3]。

竹筍殼的主要成分為纖維素、半纖維素及木質(zhì)素，約占筍殼干質(zhì)量的70%～85%。除此之外，竹筍殼還含有一定量的蛋白質(zhì)、黃酮、酚酸、茶多酚等物質(zhì)[4]。目前已有從竹筍殼中提取黃酮、木聚糖等生理活性物質(zhì)的報道，但同時反映了生理活性物質(zhì)提取后竹筍殼的處理問題[5-6]。

生物處理法是處理農(nóng)業(yè)廢棄物比較常用的方法，即利用微生物分解纖維素和半纖維素，使農(nóng)業(yè)廢棄物得到降解[7]。常用的生物處理方法就是對有機物廢棄物進行堆肥處理，有機物在微生物的作用下分解礦化、腐殖化，形成腐殖質(zhì)，從而改良土壤，促進作物生長[8-10]。由多種微生物構(gòu)成的復合微生物菌劑能充分發(fā)揮群體聯(lián)合作用優(yōu)勢，可以大大縮短腐熟時間、增加肥效、減少環(huán)境污染和安全隱患，被廣泛應用于農(nóng)業(yè)堆肥生產(chǎn)中[11-12]。宿賢超等曾在竹筍加工廢棄物筍殼中接種微生物菌劑進行堆肥化處理，結(jié)果顯示，該處理可以加速筍殼堆肥腐熟的進程[13]。但是，關(guān)于高效處理竹筍殼的微生物篩選及復合微生物菌劑的構(gòu)建尚未見報道。

本試驗擬從腐爛的竹筍殼中篩選分離獲得竹筍殼降解菌株，搭配組合構(gòu)建竹筍殼降解菌群，并確定其降解條件，以期為竹筍殼的生物處理提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

本試驗于2016年3—9月在合肥工業(yè)大學食品科學與工程學院的實驗室中進行。

1.1 主要培養(yǎng)基

PDA平板；剛果紅平板；虎紅平板；竹筍殼平板培養(yǎng)基，含2%竹筍殼，2%瓊脂；種子培養(yǎng)基：5 g麩皮，按料液比 1 g ∶1 mL 加水；竹筍殼發(fā)酵培養(yǎng)基：5 g筍殼粉粒，按料液比 1 g ∶1 mL 加水。

1.2 試驗方法

1.2.1 竹筍殼分解微生物的分離篩選 將采集的腐爛筍殼樣品通過稀釋涂布平板法接種到PDA平板、剛果紅平板、虎紅平板和竹筍殼平板培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)4～5 d，挑選菌落特征明顯的菌落，在PDA平板上劃線純化，并回接到竹筍殼發(fā)酵培養(yǎng)基上，觀察微生物的生長狀況并測定纖維素酶活性及腐殖酸量。

1.2.2 竹筍殼降解復合菌劑的篩選 將篩選出來的菌株按一定的組合接種于竹筍殼發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃培養(yǎng)4 d并測定纖維素酶活性及腐殖酸量，選出較優(yōu)組合菌群。

1.2.3 復合菌劑產(chǎn)酶條件優(yōu)化 (1)竹筍殼粉碎程度對其降解的影響。將風干的竹筍殼分別剪碎成大小為1 cm×1 cm、3 mm×3 mm的碎塊，用小型粉碎機粉碎后分別過10、40目成粗粒、粉粒，置于錐形瓶中，與水按料液比1 g ∶1 mL比例混合后接入1%復合菌劑種子，于30 ℃培養(yǎng)4 d后測定纖維素酶活性及腐殖酸含量。

(2)不同加水量對竹筍殼降解的影響。稱取5 g竹筍殼粉粒置于錐形瓶中，加水使筍殼含水率分別為40%、50%、60%、70%、80%，再接入1%復合菌劑種子混勻，于30 ℃培養(yǎng)4 d后測定纖維素酶活性及腐殖酸含量。

(3)不同溫度對竹筍殼降解的影響。稱取5 g竹筍殼粉粒于錐形瓶中，加入5 mL水及1%復合菌劑種子混勻，分別于20、25、30、35、40 ℃培養(yǎng)4 d，測定纖維素酶活性及腐殖酸含量。

(4)不同初始pH值對竹筍殼降解的影響。分別稱取5 g竹筍殼粉粒置于6個錐形瓶中，分別加入5 mL pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的水，接入1%復合菌劑種子，于30 ℃培養(yǎng)4 d，測定纖維素酶活性及腐殖酸含量。

1.3 試驗測定

1.3.1 纖維素酶活性的測定[14]準確稱取1.0 g樣品，加入由0.2 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH值6.0)配制的1%羧甲基纖維素鈉(CMC)溶液4.0 mL，60 ℃酶解20 min，然后立即加入1.0 mL 2.0 mol/L氫氧化鈉溶液和2.0 mL二硝基水楊酸(DNS)試劑，沸水煮5 min后取出，流水冷卻，定容至 25.0 mL，于540 nm處測定其D540 nm，以滅活酶液為對照。

纖維素酶酶活性單位的定義：在溫度為60 ℃、pH值為6.0條件下，以1 min催化羧甲基纖維素鈉水解生成1 μg還原糖所需要的酶量定義為1個酶活性單位(U)。

1.3.2 腐殖酸含量的測定 準確稱取2.0 g發(fā)酵基質(zhì)，加 40 mL 浸提劑(0.1 mol/L焦磷酸鈉與0.1 mol/L氫氧化鈉混合液)，振蕩，靜置過夜，過濾得浸出液，按重鉻酸鉀氧化-外加熱法[15]測腐殖酸有機碳量。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹筍殼分解微生物的分離篩選

經(jīng)過反復的分區(qū)劃線，分離純化，篩選出6株微生物，分別命名為A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6。菌落形態(tài)及顯微觀察如圖1所示，可初步鑒定A-1菌株為粉孢霉屬，A-2 菌株為毛霉屬，A-3菌株為黑曲霉屬，A-4菌株為芽孢桿菌屬，A-5菌株為諾卡氏菌屬，A-6菌株為酵母菌屬。將篩選出的菌株在竹筍殼發(fā)酵培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，測定纖維素酶活性及腐殖酸含量，詳見圖2。

由圖2可知，A-3的纖維素酶活性最高，產(chǎn)生的腐殖酸也最多，其次為A-4、A-2、A-1、A-5菌株，A-6菌株的纖維素酶活性最低，產(chǎn)生的腐殖酸也最少。

2.2 分解竹筍殼復合菌劑的篩選

在復合微生物菌劑中以A-3、A-4、A-5菌株為基本菌株，按表1設計4種微生物組合，將其接種在竹筍殼發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測得的纖維素酶活性見圖3。

由圖3可知，復合菌劑1與復合菌劑2的纖維素酶活性及腐殖酸含量相差不大，因此，A-6菌株可以不添加在復合菌劑中；而組合3的纖維素酶活性比組合4的高，因此選擇 A-1菌株添加在復合菌劑中。即篩選出優(yōu)良的微生物復合菌劑由A-3、A-1、A-4、A-5菌株組成，即為復合菌劑3，在后面的試驗中將以復合菌劑3作為竹筍殼降解微生物菌群。

表1 不同菌株組合

2.3 微生物降解竹筍殼條件的優(yōu)化

2.3.1 竹筍殼粉碎程度對其降解的影響 從圖4可以看出，將不同粉碎度的竹筍殼接入復合菌劑3種子后，竹筍殼粉碎程度的大小對產(chǎn)酶活性及腐殖酸有機碳含量的高低有很大的影響，竹筍殼粉碎程度越高，越容易被微生物降解。因此，利用微生物降解竹筍殼時原料應粉碎成粉粒。

2.3.2 竹筍殼含水率對其降解的影響 從圖5可以看出，在不同含水率的竹筍殼粉粒中添加復合菌劑3后，隨著竹筍殼含水率的提高，纖維素酶活性逐漸提高，當含水率達到70%時，酶活性達最高值，且產(chǎn)生的腐殖酸也最多；隨著含水率的進一步提高，纖維素酶活性反而逐漸降低，因此可知，合適的含水率為70%。

2.3.3 不同溫度對竹筍殼降解的影響 從圖6可以看出，將添加復合菌劑3的竹筍殼粉粒在不同溫度下進行發(fā)酵試驗，在低溫范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，其纖維素酶活性也逐漸提高，在30 ℃達峰值；隨著溫度的進一步升高，纖維素酶活性降低，但當溫度升高至35 ℃以上時，纖維素酶活性又開始升高。結(jié)果顯示，低溫時溫度越高，微生物越活躍，所產(chǎn)生的纖維素酶活性越高，在30 ℃時，嗜溫微生物最活躍，產(chǎn)生的纖維素酶活性最高；隨著溫度繼續(xù)升高，嗜溫微生物開始受到抑制，活性降低；溫度達到35 ℃以后，嗜溫微生物嚴重受到抑制，嗜熱微生物開始生長，并成為竹筍殼分解的主體，所產(chǎn)生的纖維素酶活性也提高。隨著溫度升高，腐殖酸有機碳含量呈波動下降趨勢。

2.3.4 不同初始pH值對竹筍殼降解的影響 添加復合菌劑3的竹筍殼粉粒在不同初始pH值下發(fā)酵，由圖7產(chǎn)纖維素酶的酶活性可知，在pH值為2.0～4.0時，其樣品的纖維素酶活性處于很平穩(wěn)的趨勢，pH值超過4.0之后，纖維素酶活性開始下降，并在5.5左右開始回升。當pH值為2.0～4.0 時，微生物降解竹筍殼產(chǎn)生的纖維素酶活性并沒有明顯變化，可能是因為A-3菌的產(chǎn)酸作用，使其pH值始終維持在2.0左右，于是對微生物生長的影響相同，沒有太大區(qū)別；當pH值超過4.0后，A-3菌的產(chǎn)酸作用不足以抵消pH值的變化，于是有了明顯的變化，纖維素酶活性降低，降解竹筍殼的微生物受到抑制；在pH值達到5.5之后，纖維素酶活性開始回升，可能是因為此時一些微生物受到抑制，從而使另一些生長受到抑制的微生物開始活躍起來，纖維素酶活性才有些微的回升。在不同pH值條件下，腐殖酸有機碳含量的變幅較小。

2.4 竹筍殼微生物降解前后掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，簡稱SEM)分析

由圖8對酶解前后的筍殼掃描電鏡觀察結(jié)果可知，常溫風干筍殼表面光滑，有鱗片狀結(jié)構(gòu)，高溫烘干筍殼表面粗糙，無鱗片狀結(jié)構(gòu)，但均結(jié)構(gòu)緊致，木質(zhì)纖維沒有受到破壞；而經(jīng)微生物降解后筍殼表面粗糙度大幅增加，受破壞程度嚴重，有明顯的裂紋。放大2 000倍的掃描電鏡照片顯示，竹筍殼表面附滿微生物，表明篩選出的復合菌劑對筍殼有一定的分解作用，可用于竹筍殼的廢物處理。

3 結(jié)論

從腐爛的竹筍殼中篩選出6株能分解纖維素與半纖維素的微生物，分別為粉孢霉A-1、毛霉A-2、黑曲霉A-3、芽孢桿菌A-4、放線菌A-5、酵母菌A-6。通過不同菌株組合比較其產(chǎn)酶及產(chǎn)腐殖酸能力大小，篩選出優(yōu)良的微生物復合菌劑3，由黑曲霉A-3、粉孢霉A-1、芽孢桿菌A-4和放線菌A-5組成。

通過對復合菌劑3降解竹筍殼產(chǎn)酶條件的研究表明，在粉碎為粉粒的竹筍殼中加70%的水，于溫度30 ℃、pH值 2～4的條件下進行發(fā)酵，復合菌劑降解竹筍殼的能力最強。

對竹筍殼微生物降解前后樣品進行電鏡掃描分析，發(fā)現(xiàn)降解前的筍殼結(jié)構(gòu)緊致，木質(zhì)纖維沒有受到破壞。降解后的筍殼表面有明顯的裂紋，受破壞程度嚴重，表明復合菌劑對筍殼有一定的分解作用，可用于竹筍殼的廢物處理。