謝 靖，陳 蕾，成家楊，唐 杰

(北京大學深圳研究生院，廣東深圳 518055)

隨著我國人口的增加和社會經(jīng)濟的發(fā)展，富含氮磷等廢水的大量排放已經(jīng)成為我國水環(huán)境污染的重要因素[1-2]。目前生活廢水、養(yǎng)殖廢水等富含氮磷廢水的處理，一般采用較為傳統(tǒng)的物理化學及生物處理方式，這些方法通過物理、化學或者微生物的作用將水中氮磷等污染物從水體中去除[3-4]，但是這個過程并沒有對污水中的營養(yǎng)元素進行有效利用，資源沒有得到有效利用，且其成本較大[5]。

水生植物在處理生活廢水及養(yǎng)殖廢水中因經(jīng)濟有效、資源利用率高等特點受到各國研究者的重視[6-7]。研究者利用水生植物如水葫蘆等大型水生植物處理廢水，水葫蘆等大型水生植物去除氮磷等污染物質(zhì)效率較高，但也存在植物體積大、營養(yǎng)價值低且容易產(chǎn)生二次污染等問題[8]。浮萍作為一種繁殖速度快、適應能力強、容易回收利用的小型水生植物，在去除水體污染方面尤其是生活廢水等方面有著巨大的潛力，同時浮萍可以快速積累淀粉和蛋白質(zhì)等可利用的營養(yǎng)物質(zhì)，在資源的利用方面同樣具有巨大的潛力[9-10]。

淀粉、蛋白質(zhì)是浮萍的主要營養(yǎng)成分。研究表明，在適宜的條件下浮萍的淀粉干質(zhì)量含量可以高達75%，其淀粉含量大于木薯、馬鈴薯等傳統(tǒng)作物。據(jù)Cheng等估算，浮萍大約每年單位面積水域(1 hm2)可以積累28 t淀粉[11]，浮萍的干基蛋白質(zhì)含量在理想條件下也可達26.3%～45.5%[12]。但是，現(xiàn)有的研究對浮萍的淀粉積累和蛋白質(zhì)積累研究相對比較獨立[13-14]，難以綜合評價生長條件對同一株浮萍的淀粉、蛋白質(zhì)含量及其積累能力的影響。筆者所在實驗室通過前期篩選獲得1株可以耐高氮磷含量(總氮含量50 mmol/L、總磷含量0.75 mmol/L)的浮萍植株，在適應較高氮磷含量生活廢水、養(yǎng)殖廢水去除污染物方面具有巨大潛力。結(jié)合生物學識別及DNA測序分析，該浮萍植株被鑒定為青萍5508(LemnaaequinoctialisL. 5508)。本研究通過正交試驗對該株青萍培養(yǎng)條件進行設計和控制，優(yōu)化培養(yǎng)條件，探索培養(yǎng)條件對青萍淀粉、蛋白質(zhì)含量及其積累能力的影響，以期為綜合利用青萍淀粉及蛋白質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試青萍及培養(yǎng)條件

本試驗用青萍5508(L.aequinoctialis5508)采自廣東惠州(地理位置114°29′27.8″E，22°52′47.3″N)。采集的青萍用自來水輕柔沖洗干凈后，置于底面直徑約為14 cm的塑料小桶內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)液為N-medium培養(yǎng)基[15][含0.15 mmol/L KH2PO4，1 mmol/L Ca(NO3)2·4H2O，8 mmol/L KNO3，5 μmol/L H3BO3，13 μmol/L MnCl2·4H2O，0.4 μmol/L Na2MoO4·2H2O，1 mmol/L MgSO4·7H2O，25 μmol/L FeNaEDTA]。光照培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)條件設置如下：光照度為 8 000 lx，光—暗周期為16 h(25 ℃)—8 h(15 ℃)。在試驗過程中，每天用去離子水補充蒸發(fā)散失的水分。培養(yǎng)20 d后收獲。

1.2 生長條件對青萍生物質(zhì)影響

本試驗選取5個因素研究生長條件對青萍生長的影響，各因素取4個水平。各因素及其水平如下：溫度，設為15、25、35、45 ℃；初始密度(投入青萍覆蓋水面的程度)，設為10%、30%、50%、70%；pH值，設為3.5、5.5、7.5、9.5；總氮含量，設為50、100、150、200 mg/L；總磷含量，設為5、20、50、100 mg/L。具體試驗因素水平正交設計如表1所示。

表1 正交試驗設計

1.3 青萍生物質(zhì)分析

1.3.1 青萍生物量的測定 將青萍從培養(yǎng)液中取出后，濾去自由水直至無水滴出現(xiàn)，將待測青萍均勻平鋪在吸水紙上，5 min 后測定其鮮質(zhì)量(g)。

將鮮青萍置于鼓風干燥箱中，于65 ℃烘干24 h，經(jīng)過破碎機破碎得到青萍干粉待測定。

相對生長率(relative growth rate，簡稱RGR)=(lnNt-lnN0)/t。式中：Nt為收獲時青萍的生物量，mg；N0為投入時青萍的生物量，mg；t為培養(yǎng)周期，d。

1.3.2 青萍干基蛋白質(zhì)含量的測定 稱取0.1 g青萍干粉于消化管中，加入催化劑(CuSO4)和5 mL濃硫酸，經(jīng)紅外消化儀(上海沛歐分析儀器有限公司，SKD-08S2)于450 ℃消化3 h，冷卻到室溫后加入過量強堿(濃NaOH溶液)，用凱氏定氮儀(上海沛歐分析儀器有限公司，SKD100)高溫蒸餾，并用已知含量和體積的鹽酸(過量)進行吸收，最后用電位滴定儀(上海儀點科學儀器股份有限公司，雷磁ZDJ-5)滴定，計算樣品氮含量。通過樣品氮含量計算青萍蛋白質(zhì)含量：樣品蛋白質(zhì)含量(g)=樣品總氮含量(g)×12.5。

1.3.3 青萍淀粉含量測定 稱取10～15 mg青萍干粉于 50 mL 離心管中，加入10 mL 80%乙醇溶液，混勻后，置于 95 ℃ 恒溫水浴10 min，于1 500 r/min離心10 min，棄去上清液，重復上述乙醇提取步驟共3次，至上清液澄清；然后在 50 ℃ 恒溫水浴中蒸發(fā)掉剩余的乙醇，向剩余的固體中加入 4.0 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，混勻后，于50 ℃水浴30 min(水浴期間混勻2～3次)；然后加入5.0 mL 0.1 mol/L乙酸溶液，混勻后加入1 mL淀粉水解混合酶液(水解酶購自Sigma公司，混合酶液含2 U/mL淀粉葡萄糖苷酶和 400 U/mL α-淀粉酶)，50 ℃水浴24 h。于2 500 r/min離心10 min，取上清液，用葡萄糖乳酸生物傳感器分析儀(山東省科學院生物研究所，SBA-40E)檢測葡萄糖的含量。淀粉含量的計算公式如下：

1.3.4 青萍蛋白質(zhì)的氨基酸分析 將青萍干粉充分粉碎后，用酸(鹽酸)水解后用日立科技有限公司的氨基酸分析儀L-8900進行氨基酸成分和含量的分析[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計方法

本試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016進行分析和處理。在同一因素下各水平數(shù)據(jù)使用SPSS軟件，用Duncan’s法進行多組樣本差異顯著性分析，并用不同小寫字母表示其顯著性(α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長條件對青萍生物量的影響

如圖1所示，在所測試的5個影響因素中，最大RGR出現(xiàn)在25 ℃條件下，達到0.140，而最低RGR則出現(xiàn)在初始密度為70%的條件下，僅為0.064。青萍在各試驗組生長狀態(tài)良好，但在溫度組45 ℃的條件下，青萍已不能很好地繁殖擴增，青萍生長停滯甚至部分死亡，僅部分存活且生物量沒有增長，可見過高的溫度會讓青萍的生長受到限制，青萍品種并不能在45 ℃條件下正常生長，因此在45 ℃條件下的數(shù)據(jù)未列出。

由圖1可以看出：(1)青萍在25 ℃條件下表現(xiàn)出最大的RGR(0.140)，且顯著(P<0.05)高于15、35 ℃時的RGR。(2)初始密度對青萍的生長具有重要影響，RGR伴隨著初始密度的升高而升高，在30%初始密度條件下達到最大值，RGR為0.112，顯著大于其他各水平(P<0.05)；但隨著初始密度的繼續(xù)增加，RGR呈遞減趨勢，這表明在高密度條件下青萍的生長受到了抑制，可能是由植株間的競爭關系造成的。(3)青萍的RGR總體伴隨著pH值升高而降低，在pH值為5.5的條件下青萍的RGR最大，為0.096，略大于pH值為 3.5 時的RGR(0.095)；當pH值從5.5上升至7.5、9.5偏堿性條件下時，其RGR顯著下降(P<0.05)；在pH值為9.5的條件下其RGR達到最低值，為0.082，顯著低于其他pH值水平(P<0.05)，但青萍仍然處于生長繁殖狀態(tài)。可見青萍表現(xiàn)出對pH值的廣泛適應性，在pH值范圍為3.5～9.5時均能生長。Tang等報道，在太湖、巢湖流域廣泛存在青萍，且屬于優(yōu)勢種群，而青萍對環(huán)境pH值條件的廣泛適應性很可能是其在自然水體中有著極其廣泛分布的重要原因之一[17-18]。(4)在總氮含量為50 mg/L的條件下，青萍的RGR最低，僅為 0.083，且顯著低于總氮含量其他水平(P<0.05)?？偟繛?00 mg/L時，RGR為0.097；隨著總氮含量進一步增加至150 mg/L，RGR并未進一步提高，反而出現(xiàn)一定程度的下降；但隨著總氮含量的繼續(xù)增大，RGR又恢復到100 mg/L含量條件下的水平。RGR在總氮含量為150 mg/L時突然下降，可能是由試驗存在一定的生物學誤差造成的?？傮w來看，總氮含量高于100 mg/L時，總氮已經(jīng)不再是青萍生長的限制條件，因此隨著總氮含量的進一步增大，RGR并未顯著提高。(5)總磷含量對青萍的生長也有顯著影響。隨著總磷含量的增加，RGR也增加并在總磷含量為20 mg/L時達到最大值(0.116)，且顯著(P<0.05)大于其他各水平的RGR。但是隨著總磷含量的進一步增大，RGR呈遞減趨勢，在總磷含量為100 mg/L時降至最低值，為0.079。

綜合5個因素對青萍的RGR影響可以得出，最適合青萍生物量積累的培養(yǎng)條件為溫度25 ℃、初始密度30%、pH值5.5、總氮含量100 mg/L、總磷含量20 mg/L。

2.2 生長條件對青萍淀粉含量的影響

如圖2所示，青萍在pH值為9.5時，淀粉含量達到最大值，達15.3%，在總磷含量為50 mg/L的條件下淀粉含量最低，為5.5%。

由圖2還可以看出：(1)溫度對青萍的淀粉含量有顯著影響。隨著溫度的升高，淀粉含量呈遞減趨勢。在較低溫度條件下(15、25 ℃)，青萍淀粉含量顯著(P<0.05)大于35 ℃條件下的淀粉含量。該結(jié)果與張飛等的研究結(jié)果[19]一致，表明低溫條件更有利于青萍淀粉的積累。(2)初始密度對青萍淀粉含量有重要影響。隨著初始密度的提高，淀粉含量逐漸上升。初始密度在10%、30%、50%的條件下，青萍的淀粉含量比較穩(wěn)定，為8%左右；當初始密度達70%時，青萍淀粉含量會達到12.5%，顯著高于其他條件(P<0.05)。這與趙昭等關于生物量與淀粉積累的研究結(jié)論[20]一致，即青萍在較高生物密度條件下有利于淀粉的積累。(3)總氮含量對青萍淀粉含量的影響并不顯著。在 150 mg/L 總氮含量條件下，淀粉含量最高，為10.4%，在 200 mg/L 總氮含量條件下，淀粉含量最低(8.8%)。(4)總磷含量對青萍淀粉積累具有顯著影響。隨著總磷含量的升高，淀粉含量迅速降低，并在 50 mg/L 條件下達到最低值，淀粉含量為5.5%，隨后在 100 mg/L 總磷含量條件下，淀粉含量出現(xiàn)一定程度的上升，但仍顯著低于較低總磷含量(5 mg/L)下的淀粉含量(P<0.05)。

綜合以上結(jié)果，青萍淀粉含量的最優(yōu)條件為溫度15 ℃、初始密度70%、pH值9.5、總氮含量150 mg/L、總磷含量 5 mg/L。通過極差分析，對青萍淀粉積累影響程度最高的3個因素依次為pH值、總磷含量及溫度，總氮含量對青萍的淀粉含量積累影響最小。

理論上，提高青萍的生長速率可以收獲更多的青萍生物量從而獲得更多的淀粉，但生長速率與淀粉含量并不呈正相關。本試驗結(jié)果表明，青萍的淀粉積累量與相對生長速率呈現(xiàn)出一定的負相關關系(圖1、圖2)。趙昭等曾指出，在青萍生長的后期，淀粉的積累與生長速率呈現(xiàn)一定的負相關關系[20]；Xiao等也指出，青萍的淀粉含量與青萍的生長速率呈現(xiàn)出一定的負相關關系[13]。在實際應用中，可以通過適當降低青萍培養(yǎng)溫度、提高pH值等方法，降低青萍生長速率，從而提高青萍的淀粉含量，以期收獲更高淀粉含量的青萍生物質(zhì)。

2.3 生長條件對青萍蛋白質(zhì)含量的影響

由圖3可以看出，青萍在15 ℃的條件下，蛋白質(zhì)含量最高，為28.1%，在總磷含量為5 mg/L的條件下蛋白質(zhì)含量最低，為16.1%。

由圖3還可以看出：(1)溫度對青萍蛋白質(zhì)含量的影響表現(xiàn)為，在較低溫度下，蛋白質(zhì)含量較高。在溫度為15 ℃的條件下，蛋白質(zhì)含量最高，為28.1%，并顯著高于其他水平(P<0.05)。(2)初始密度對青萍蛋白質(zhì)含量影響顯著。在較低初始密度條件下，青萍蛋白質(zhì)含量較高，隨著初始密度的增加，蛋白質(zhì)含量逐漸下降。在10%的初始密度下，蛋白質(zhì)含量最高，為22.3%，并顯著高于其他各水平(P<0.05)；在70%的初始密度條件下，青萍蛋白質(zhì)含量最低，為17.3%。(3)青萍在偏酸性或者中性條件下，蛋白質(zhì)含量并沒有顯著變化，在堿性條件下其蛋白質(zhì)含量顯著下降。在pH值為9.5的條件下，其蛋白質(zhì)含量為17.9%，顯著低于其他pH值水平(P<0.05)。在pH值為3.5的條件下，青萍蛋白質(zhì)含量最高，為20.6%，略高于pH值為5.5、7.5條件下的蛋白質(zhì)含量。(4)總氮含量對青萍蛋白質(zhì)含量具有重要的影響。在較高總氮含量(200 mg/L)條件下，青萍具有最高的蛋白質(zhì)含量，為21.6%，并顯著高于其他各水平(P<0.05)，而在較低總氮含量(50 mg/L)條件下，青萍的蛋白質(zhì)含量最低，為 15.48%。張浩等在250 mg/L總氮含量下篩選得到較高蛋白質(zhì)含量的青萍[21]，與本試驗結(jié)果較為接近，說明總氮對蛋白質(zhì)積累有重要的影響。

綜合以上因素，青萍蛋白質(zhì)含量的最優(yōu)條件為溫度 15 ℃、初始密度10%、pH值3.5、總氮含量 200 mg/L、總磷含量20 mg/L。對青萍蛋白質(zhì)積累影響程度較高的3個因素依次為總磷、總氮、初始密度，pH值條件對青萍蛋白質(zhì)含量的積累影響最小。

值得指出的是，青萍的蛋白質(zhì)含量對應總氮含量的變化與RGR對應總氮含量的變化較為一致(圖1、圖3)，青萍的淀粉含量也隨著總氮含量增大而有一定的增大，但并不顯著。在實際應用中，如果以利用青萍蛋白質(zhì)為目的進行培養(yǎng)，可增加總氮含量，既可以提高RGR，也可以得到更高蛋白質(zhì)含量的青萍生物質(zhì)，取得更好的控制效果。

2.4 生長條件對青萍淀粉、蛋白質(zhì)生產(chǎn)能力的影響

淀粉和蛋白質(zhì)的生產(chǎn)能力也是優(yōu)化青萍培養(yǎng)條件的重要參考，表2為試驗期內(nèi)各因素各水平的淀粉、蛋白質(zhì)的平均生產(chǎn)能力。

注：溫度的1～4水平分別對應15、25、35、45 ℃；初始密度的1～4水平分別對應10%、30%、50%、70%；pH值的1～4水平分別對應3.5、5.5、7.5、9.5；總氮含量的1～4水平分別對應50、100、150、200 mg/L；總磷含量的1～4水平分別對應5、20、50、100 mg/L。

在25 ℃條件下，無論是淀粉還是蛋白質(zhì)的積累能力都是最高的。青萍的淀粉積累能力在較低的初始密度條件下較弱，初始密度的提高可以提高青萍對淀粉的積累速度，其蛋白質(zhì)積累能力則表現(xiàn)出在適中的初始密度下積累能力較強，過高或者過低的初始密度都會降低青萍積累蛋白質(zhì)的速度。相較于酸性環(huán)境，在偏堿性條件下，青萍淀粉積累速度較快；而蛋白質(zhì)積累能力則與之相反，在偏酸性條件下，青萍的蛋白質(zhì)積累能力較強，而在偏堿性條件下，蛋白質(zhì)積累能力較弱。在 100 mg/L 的總氮含量下，青萍的淀粉和蛋白質(zhì)積累能力都是最強的。在較低的總磷含量下，青萍的淀粉積累能力更強，20 mg/L 總磷含量青萍的蛋白質(zhì)積累能力最強，過高或者過低的總磷含量都會降低青萍積累蛋白質(zhì)的能力。

2.5 青萍的氨基酸組成及含量

在以青萍蛋白質(zhì)為原料進行加工利用的實際生產(chǎn)中，其蛋白質(zhì)的氨基酸組成及含量是評價其作為蛋白質(zhì)原料質(zhì)量的重要依據(jù)。為了更好地評價青萍蛋白質(zhì)作為原料的利用價值，本研究分析了青萍的氨基酸組成及其含量。

表3結(jié)果表明，青萍樣品中氨基酸總量達197.10 mg/g，氨基酸含量最高的是天冬氨酸，達33.85 mg/g，占氨基酸總量的17.17%，其次是亮氨酸，為21.43 mg/g，占氨基酸總量的10.87%。必需氨基酸中亮氨酸含量最高，達 21.43 mg/g，占氨基酸總量的10.87%，其次是纈氨酸，為12.52 mg/g，占氨基酸總量的6.35%，含量最低的是甲硫氨酸，為 1.57 mg/g，占氨基酸總量的0.80%。需要特別指出的是，動物第一限制性氨基酸賴氨酸在青萍中的含量較高，達 8.93 mg/g，占氨基酸總量的4.53%，占必需氨基酸的12.18%，高于常見飼料原料玉米、高粱、小麥等[13，22-23]。青萍的必需氨基酸總量達73.31 mg/g，占氨基酸總量(TAA)的37.20%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值(EAA/NEAA)為59.42%，這與世界衛(wèi)生組織(WHO)/聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)推薦的EAA/TAA=40%、EAA/NEAA=60%[21]非常接近。這些結(jié)果表明，青萍中蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值較高，在利用其蛋白質(zhì)作為飼料原料等方面潛力巨大。

3 結(jié)論

(1)青萍在溫度為25 ℃、初始密度為30%、pH值為5.5、總氮含量為100 mg/L、總磷含量為20 mg/L的條件下，相對生長速率最快；(2)青萍在溫度為15 ℃、初始密度為70%、pH值為9.5、總氮含量為150 mg/L、總磷含量為5 mg/L的條件下，淀粉含量達到最優(yōu)；(3)青萍在溫度為15 ℃、初始密度為10%、pH值為3.5、總氮含量為200 mg/L、總磷含量為 20 mg/L 的條件下，蛋白質(zhì)含量達到最優(yōu)；(4)在本試驗周期內(nèi)，單位面積、單位時間積累的淀粉量最大的條件為溫度 25 ℃、初始密度50%、pH值9.5、總氮含量100 mg/L、總磷含量5 mg/L，而蛋白質(zhì)量最大的條件為溫度25 ℃、初始密度30%、pH值3.5、總氮含量100 mg/L、總磷含量20 mg/L；(5)青萍的氨基酸組成合理，接近WHO/FAO推薦的理想蛋白質(zhì)氨基酸模式，具有作為蛋白或飼料原料的潛力。

表3 青萍的氨基酸組成及含量

注：標注“*”的表示必需氨基酸。

根據(jù)青萍在不同生長條件下生物質(zhì)、蛋白質(zhì)及淀粉積累的特點，可在生產(chǎn)實際中有針對性地對青萍進行控制，為青萍的種屬篩選以及蛋白質(zhì)、淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)的進一步利用提供指導。