王月華，王變變，尹旭升，付崇羅，玄紅專

(1.聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東聊城 252059； 2.山東省蜂業(yè)與蜂產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，山東泰安 271000)

蜂膠是西方蜜蜂采集植物樹脂并混入唾液腺分泌物后經(jīng)加工咀嚼而成的一種樹脂狀物質(zhì)。蜂膠作為一種重要的蜂產(chǎn)品，已有研究表明其具有豐富而獨(dú)特的生物活性物質(zhì)，具有抗細(xì)菌、抗病毒、抗炎癥、抗腫瘤、抗真菌等作用[1-5]。目前，從蜂膠中鑒定出的化學(xué)組分多達(dá)20多類、300多種，主要包括黃酮類、酚酸類、萜烯酸、類固醇類、氨基酸類[6-8]等物質(zhì)。蜂膠易溶于有機(jī)溶劑，目前對中國蜂膠乙醇提取物(ethanol extract of Chinese propolis，簡稱EECP)的研究比較深入，對中國蜂膠水提物(Chinese propolis water extract，簡稱CPWE)的研究較少。中國蜂膠水提物不僅可以避免有機(jī)溶劑對動物產(chǎn)生的有害作用[9]，而且有研究發(fā)現(xiàn)，中國蜂膠水提物有較好的生物活性，具有非常好的應(yīng)用價值，正越來越來得到人們的重視[10]。

本研究使用的中國蜂膠水提物是通過制備高效液相色譜(preparative high performance liquid chromatography，簡稱PHPLC)和大孔吸附樹脂(macroprous adsorption resin，簡稱MAR)的方法，分離純化出11種化學(xué)成分(咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、3，4-二甲氧基肉桂酸、短葉松素、咖啡酸芐酯、咖啡酸苯乙酯、芹菜素、松屬素、白楊素、高良姜素)[11]。通過磺酰羅丹明B(sulforhodamine B，簡稱SRB)法檢測CPWE及其分離純化的11種化學(xué)成分對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U87和U172)的影響，以期發(fā)現(xiàn)蜂膠水提物的抗腫瘤功效成分，為蜂膠水提物的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

中國蜂膠產(chǎn)自山東省，膠源植物主要為楊樹；巴西綠膠取自巴西Minas Gerais州，主要植物來源為酒神菊屬。主要試劑有DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；胰酶、磺酰羅丹明B(美國Sigma公司)；細(xì)胞培養(yǎng)皿、96孔板(美國Falcon公司)；三羥甲基氨基甲烷[Tris，生工生物工程(上海)股份有限公司]。其他試劑均為分析純。

中國蜂膠水提物和中國蜂膠乙酸乙酯提取物(ethyl acetate extract of Chinese propolis，簡稱EAEP)從中國蜂膠中分離、提純，并經(jīng)紫外光譜(ultraviolet-visible spectrum，簡稱UV)和核磁共振(nuclear magnetic resonance，簡稱NMR)鑒定，純度為98%以上[11]。U87和U172細(xì)胞由本試驗(yàn)所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要儀器

Heal Force生物安全柜、Heal Force CO2培養(yǎng)箱，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；TE2000S倒置熒光顯微鏡，日本Nikon公司；MK3酶標(biāo)儀，芬蘭雷勃公司；AR2140電子分析天平，美國奧豪斯公司；Milli-Q Synthesis超純水系統(tǒng)，美國密理博公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蜂膠中主要組分的制備 (1)提取。依次以水、乙酸乙酯為溶劑對蜂膠中的主要化學(xué)成分進(jìn)行提取，其中水提取物中富含酚酸及其酯，乙酸乙酯提取物中富含黃酮。

(2)粗分離。利用各種色譜技術(shù)對蜂膠提取物進(jìn)行粗分離，水提取物和乙酸乙酯提取物可以分別使用大孔吸附樹脂及聚酰胺實(shí)現(xiàn)粗分離。通過對試驗(yàn)參數(shù)(如樹脂的類型、上樣量、流動相的組成、流速等)進(jìn)行優(yōu)化，建立最佳試驗(yàn)方案。

(3)進(jìn)一步分離與純化。利用各種色譜技術(shù)(超臨界流體色譜、制備型高效液相色譜)對蜂膠中多酚類物質(zhì)的制備型分離純化方法進(jìn)行研究，對試驗(yàn)參數(shù)(如固定相的種類、流動相的組成、流速、溫度、壓力、上樣量等)進(jìn)行優(yōu)化，建立綠色環(huán)保、高效快速的分離純化方法。

(4)結(jié)構(gòu)鑒定。利用X射線單晶衍射、核磁共振、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(high performance liquid chromatography-mass spectrometry，簡稱HPLC-MS)、紅外光譜(infra-red spectrum，簡稱IR)、紫外光譜等多種鑒定手段對分離得到的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，以闡明蜂膠中的主要化學(xué)組成。蜂膠主要成分的色譜結(jié)果見圖1。

1.3.2 細(xì)胞的培養(yǎng) U87和U172細(xì)胞培養(yǎng)在添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。孵育在含有5% CO2、37 ℃、飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中。在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.3 細(xì)胞存活率的測定 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞按 4 000個/孔 種植到96孔板中，于37 ℃、5% CO2條件下孵育，待腫瘤細(xì)胞長到60%以上，除正常組外，將所有處理組分別經(jīng)不同濃度的中國蜂膠乙醇提取物、巴西綠膠乙醇提取物、中國蜂膠水提取物、中國蜂膠乙酸乙酯提取物(25、50、100 mg/L)及中國蜂膠水提取物分離純化的11種化學(xué)成分(40、80、160 μmol/L)分別處理24、48 h后，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用10%三氯乙酸于4 ℃固定1 h，然后用SRB染色10 min，晾干，用100 mmol/L Tris堿溶解，在492 nm處測吸光度。細(xì)胞存活率計(jì)算公式如下：

細(xì)胞存活率=[D492 nm(處理)/D492 nm(對照)]×100%。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度中國蜂膠水提物中4種酸類化學(xué)成分對U87和U172細(xì)胞存活率的影響

由圖2可以看出，不同濃度的中國蜂膠水提物中4種酸類化學(xué)成分對U87和U172細(xì)胞均沒有細(xì)胞毒性。

2.2 不同濃度的中國蜂膠水提物中5種黃酮類化學(xué)成分對U87和U172細(xì)胞存活率的影響

由圖3可以看出，不同濃度的中國蜂膠水提物中5種黃酮類化學(xué)成分對U87和U172的細(xì)胞活性不同。芹菜素對U87和U172細(xì)胞的抑制效果最強(qiáng)，48 h時160 μmol/L芹菜素抑制率均達(dá)到55%以上，短葉松素抑制效果最弱，48 h時160 μmol/L芹菜素抑制率僅為9.4%左右。

2.3 不同濃度的中國蜂膠水提物中2種酯類化學(xué)成分對U87和U172細(xì)胞存活率的影響

由圖4可以看出，不同濃度的中國蜂膠水提物中2種酯類化學(xué)成分對U87和U172的細(xì)胞活性不同。咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethylester，簡稱CAPE)對細(xì)胞的抑制效果更強(qiáng)，48 h時160 μmol/L對U172細(xì)胞的抑制率達(dá)到79.3%。

2.4 不同濃度的中國蜂膠水提物、乙醇提取物與乙酸乙酯提取物，巴西蜂膠乙醇提取物(EEBP)對U172細(xì)胞存活率的影響

由圖5可以看出，在不同濃度的CPWE處理下，EEBP和EECP對U87和U172的細(xì)胞活性不同。EEBP對U87和U172細(xì)胞基本沒有細(xì)胞毒性。中國蜂膠乙酸乙酯提取物和乙醇提取物只有當(dāng)濃度高于50 mg/L時，才顯著抑制U87和U172細(xì)胞增殖，并且具有明顯的時間依賴性。

3 討論

蜂膠是西方蜜蜂采集植物樹脂加工而成的一種黏稠物質(zhì)，具有多種藥理學(xué)活性，長期在民間得以應(yīng)用。但是目前蜂膠應(yīng)用中最大的困難就是藥效不穩(wěn)定、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確。本試驗(yàn)通過對蜂膠水提物中11種組分的抗腫瘤活性研究發(fā)現(xiàn)，蜂膠中發(fā)揮抗腫瘤活性的物質(zhì)基礎(chǔ)主要為咖啡酸苯乙酯和一系列由黃酮類化合物構(gòu)成的活性成分群，蜂膠中的有機(jī)酸類化合物抗腫瘤效果相對較弱，而蜂膠中具體發(fā)揮生物活性作用的活性成分群需要進(jìn)一步發(fā)掘、研究。

不同提取方法會影響蜂膠的抗腫瘤功效，蜂膠在水中溶解度較低，因而蜂膠水提物的抗腫瘤功效較弱；蜂膠易溶于有機(jī)溶劑，因而蜂膠乙醇提取物和乙酸乙酯提取物均具有較好的抗腫瘤功效。

不同地區(qū)蜂膠植物來源不同，決定了蜂膠的化學(xué)成分不同，中國楊樹型蜂膠主要成分為酚酸類和黃酮類化合物，而巴西蜂膠主要為香豆酸類，由于化學(xué)組分不同，中國蜂膠乙醇提取物和巴西蜂膠乙醇提取物抗腫瘤功效不同，巴西蜂膠抗腫瘤功效較弱。