張生元，鄭瑞珠，艾桃山，喻運珍，張立強，周偉東，鄧 平，丁桂珍

(1.武漢中博水產(chǎn)生物技術有限公司，湖北武漢 430070； 2.武漢市農(nóng)業(yè)科學技術研究院水產(chǎn)科學研究所，湖北武漢 430207)

檸檬酸桿菌(Citrobacter)是一類條件性致病菌，在水、土壤、動物及人類腸道中廣泛分布[1]。其中弗氏檸檬酸桿菌桿菌(C.freundii)、布氏檸檬酸桿菌(C.braakii)、科氏檸檬酸桿菌(C.koseri)可引起人的菌血癥、尿路感染、急性腹膜炎、膽囊炎等，是感染人類的常見菌群之一[2-4]。同時研究表明，檸檬酸桿菌致病菌株也可以造成水生生物[中華絨毛蟹(Eriocheirsinensis)[5]、鱘(sturgeon)[6]]和哺乳動物[綿羊(sheep)[7]]等出現(xiàn)敗血癥并死亡。近年來，人類感染布氏檸檬酸桿菌患病的報道日漸增多，但并未從患病克氏原螯蝦中分離得到。布氏檸檬酸桿菌(布拉克枸櫞酸桿菌)是革蘭氏陰性短桿菌[1]。湖北省某養(yǎng)殖場發(fā)生克氏原螯蝦死亡情況，經(jīng)理化方法和分子生物學鑒定，確定其病原為布氏檸檬酸桿菌，并對其耐藥性進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 病料來源

患病克氏原螯蝦采自湖北省某養(yǎng)殖場，患病蝦體質(zhì)量約20 g，體長約7 cm，主要表現(xiàn)為活力降低、行動遲緩，解剖后頭胸甲內(nèi)有較多組織液流出。無菌采取肝胰腺，進行實驗室病原分離培養(yǎng)。

1.2 材料與試驗動物

胰蛋白大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白大豆肉湯(TSB)，均購自山東省青島市高科園海博生物技術有限公司。10×Buffer、dNTP、TaqDNA聚合酶、切膠回收試劑盒、pMD18-T vector及大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，均購自寶生物工程(大連)有限公司。所有化學試劑，均購于進口或國產(chǎn)分析純。試驗相關引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成，核酸序列測序均由天一輝遠生物科技有限公司完成。10種抗生素來自武漢中博水產(chǎn)生物技術有限公司。健康克氏原螯蝦30尾，平均體質(zhì)量為20～25 g，采自湖北省某養(yǎng)殖場。

1.3 病原菌的分離與純化

無菌采集患病蝦的肝胰腺組織，涂布在TSA培養(yǎng)基上，于37 ℃下培養(yǎng)18～24 h后觀察菌落形態(tài)，挑取單一菌落進行革蘭染色，鏡檢觀察，將單一形態(tài)細菌在TSB液體培養(yǎng)基中增殖備用，并將獲得的單一形態(tài)的菌株命名為X2016。

1.4 生化試驗

取完成增殖的X2016菌株進行生化試驗，試驗結(jié)果參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》。

1.5 16S rRNA基因序列分析

采用CTAB法提取細菌DNA，提取后的細菌DNA經(jīng)核酸電泳驗證后，置于-20 ℃冰箱保存。

擴增引物為[8]：16S-F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；16S-R，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。反應總體系25 μL：DNA模板0.5 μL，上下游引物各1 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 2.5 μL，TaqDNA聚合酶0.2 μL，去離子滅菌水 17.3 μL。

16S rRNA基因擴增反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段，進行T載體克隆，并對重組質(zhì)粒進行測序。測序結(jié)果比對拼接后在NCBI上在線分析。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

將菌株X2016與已報道的不同種檸檬酸桿菌的16S rRNA核酸序列進行比較分析，利用Clustal X軟件進行比對排列，采用MEGA 6.0軟件[9]進行系統(tǒng)發(fā)育分析，用Neighbour-joining方法和Kimura 2-parameter校正軟件進行同源性比較并構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并通過自舉分析(boostrap)1 000 次重復檢測分析系統(tǒng)的置信度。

1.7 藥物敏感試驗

選用10種常用抗生素對X2016菌株進行抑菌試驗：氟苯尼考(99.8%)、恩諾沙星(98.9%)、鹽酸多西環(huán)素(99.8%)、硫酸新霉素(99.8%)、氯霉素(99.9%)、環(huán)丙沙星(99.8%)、紅霉素(99.7%)、阿莫西林(99.9%)、慶大霉素(99.8%)和阿奇霉素(99.9%)。藥敏試驗采用微量稀釋法對菌株X2016進行MIC(minimal inhibitory concentration)測定。

1.8 動物回歸試驗

將菌株X2016無菌接種至TSA平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)后，挑取單菌株至TSB液體培養(yǎng)基中，180 r/min、37 ℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期(18～24 h)。細菌懸液離心去上清后，用無菌生理鹽水10倍梯度稀釋后涂布至TSA培養(yǎng)基上，平板計數(shù)，計算細菌懸液濃度為5.0億CFU/mL，隨后用無菌PBS緩沖液制備菌懸液。

選取健康克氏原螯蝦30尾，平均分為2組：A組為對照組；B組為試驗組，采用浸泡方式感染，往試驗組中添加 1.0億CFU/mL 菌株X2016。保證一致的養(yǎng)殖環(huán)境，連續(xù)觀察 3 d。記錄克氏原螯蝦死亡情況，及時對死亡克氏原螯蝦進行解剖，并分離鑒定病原。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的純化分離

菌株X2016接種在TSA培養(yǎng)基上并于37 ℃培養(yǎng)24 h，菌落形態(tài)單一、呈圓形，其表面光滑、濕潤，半透明狀，鏡檢結(jié)果為革蘭染色陰性，呈短桿狀，兩邊鈍圓(圖1)。

2.2 生化試驗

生化試驗結(jié)果(表1)顯示，分離株X2016參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》進行對比，其生化特性與布氏檸檬酸桿菌一致，初步確定為布氏檸檬酸桿菌。

表1 分離株X2016的生理生化特征

注：“+”表示陽性；“-”表示陰性。

2.3 16S rRNA序列分析

采用試劑盒提取X2016的DNA，以其為模板進行PCR擴增16S rRNA基因。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得目的片段長約1 500 bp(圖2)。

2.4 系統(tǒng)進化分析

測序結(jié)果在數(shù)據(jù)庫中進行比對，應用MEGA 6.0構建系統(tǒng)進化樹(圖3)，X2016株與布氏檸檬酸桿菌(GenBank登錄號為HQ288930.1)BLAST軟件比對結(jié)果顯示，同源性為99%，且與其為同一分支，置信度為91%。

2.5 藥敏試驗

由表2可知，分離菌株X2016對氟苯尼考、恩諾沙星、鹽酸多西環(huán)素、硫酸新霉素、氯霉素和環(huán)丙沙星敏感，對X2016菌株具有良好的抑菌效果，且X2016菌株對氟苯尼考敏感性最強。X2016菌株對紅霉素、阿莫西林、慶大霉素、阿奇霉素耐藥。

2.6 動物回歸試驗

試驗組克氏原螯蝦通過浸泡方法接種布氏檸檬酸桿菌X2016，12 h開始出現(xiàn)行動遲緩的現(xiàn)象，36 h后出現(xiàn)死亡，72 h內(nèi)試驗組全部死亡，致死率為100%。試驗組克氏原螯蝦經(jīng)解剖后頭胸甲內(nèi)有較多組織液流出。試驗組克氏原螯蝦肝胰腺組織中分離到與X2016形態(tài)特征、生化性質(zhì)一致的細菌，而對照組未分離出該細菌。

表2 分離株X2016的藥敏試驗結(jié)果

注：“S”表示敏感；“R”表示耐藥。

3 討論與結(jié)論

布氏檸檬酸桿菌屬于檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，是一種條件致病菌，能引起人類食物中毒[2-4]。在水生動物中報道較少，其傳播機制尚不明確，對于其毒力及毒力相關的蛋白研究還在探索中[10]。

本研究從患病克氏原螯蝦肝胰腺組織中順利分離得到細菌，進行革蘭氏染色、生化試驗，并將其16S rRNA序列與檸檬酸桿菌屬不同種構建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果顯示，該菌株為布氏檸檬酸桿菌。藥敏試驗表明，分離株X2016對氟苯尼考、恩諾沙星、鹽酸多西環(huán)素、硫酸新霉素、氯霉素和環(huán)丙沙星敏感，與從中華鱉及綿羊體內(nèi)分離得到的菌株藥物敏感性互相間都存在差異[7，11]，這可能是由于動物源和地域的差異。目前，對布氏檸檬酸桿菌的相關致病研究相對較少，直至2013年才初步建立布氏檸檬酸桿菌的PCR檢測方法[12]。

本研究首次報道從克氏原螯蝦中分離得到布氏檸檬酸桿菌，并對其藥敏性進行初步研究，為該病的防治提供了理論依據(jù)。由于該菌主要在細胞內(nèi)繁殖，抗菌藥物和抗體均不易進入，從而該病很難根治[4]。為防止耐藥株的產(chǎn)生、減少疾病復發(fā)并提高療效，考慮聯(lián)合用藥，延長抗菌治療時間。養(yǎng)殖過程中使用抗生素時應根據(jù)藥敏結(jié)果合理地選用抗生素，減少抗生素濫用對養(yǎng)殖環(huán)境微生態(tài)平衡的破壞以及對人類帶來的潛在危害[13]。

布氏檸檬酸桿菌作為條件致病菌，無論是侵襲性的還是非侵襲性的，都有可能引起人類的菌血癥，導致食物中毒[4]。結(jié)合克氏原螯蝦食物中毒的癥狀[14](嘔吐、全身無力)，本研究不排除克氏原螯蝦食物中毒是由布氏檸檬酸桿菌引起的可能性，并在后續(xù)研究中進行相關工作。