奚衍洋，趙云蛟，錢愛東

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118)

主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，簡稱MHC)是一類細(xì)胞表面糖蛋白，它能夠在細(xì)胞內(nèi)通過蛋白水解作用結(jié)合源自宿主和病原體蛋白質(zhì)的小肽片段。之后，MHC分子會將這些抗原表位呈遞到細(xì)胞表面，在那里它們被T細(xì)胞識別，這可以幫助免疫系統(tǒng)識別和應(yīng)對外來抗原[1-2]。MHC由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等3類分子組成，前2類分子對抗原肽起到遞呈作用，而第Ⅲ類分子與免疫反應(yīng)相關(guān)[3]。

按照MHC基因國際命名原則，除了小鼠(H-2)、大鼠(RT1)和雞(B)，剩余動物MHC的命名即在白細(xì)胞抗原(LA)前加上本物種英文名稱的首字母或是前2個字母，例如人、馬、牛、綿羊、狗的MHC分別為HLA、ELA、BoLA、OLA、DLA，因此豬的MHC亦稱為SLA。MHC分子的發(fā)現(xiàn)及提出源于距今60多年前有關(guān)小鼠的免疫試驗(yàn)[4]，之后Jean Dausset發(fā)現(xiàn)第一個能夠抗人類白細(xì)胞表達(dá)抗原的同種抗體，成為了人類HLA基因的研究開端[5-7]。豬SLA基因是由Vaiman等[8]首次提出其具有編碼抗體、調(diào)控免疫的作用，隨后由Lunney等[9]同Mallard等[10]經(jīng)試驗(yàn)論證了該結(jié)論，且證實(shí)了SLA分子對機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)及抗原呈遞等方面均起到較大作用。

SLA基因多態(tài)性對于免疫反應(yīng)的研究是至關(guān)重要的[11]。SLAⅡ類基因能夠調(diào)控外來病原和疫苗的免疫應(yīng)答反應(yīng)[12]，即控制傳染病的反應(yīng)及影響疫苗的特異性和有效性[13]。據(jù)證實(shí)SLAⅡ類基因的匹配度是實(shí)體器官同種異體移植和骨髓細(xì)胞移植成功與否的重要條件[14]。本研究通過直接測序法從DNA水平對SLAⅡ-DRB1座位第二外顯子的多態(tài)性進(jìn)行了分析，且從多方面解析豬的SLAⅡ類分子基因特征，為抗豬病原體的相關(guān)免疫研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料采自吉林長春某豬場共計20頭成年長白豬血液。將采集的豬血置于抗凝管并混勻，低溫凍存以備試驗(yàn)。

1.2 基因組的提取及PCR擴(kuò)增

利用Axyprep血基因組提取試劑盒，從豬的血液樣本中提取基因組。大約1 μL基因組DNA模板，各0.2 μL豬P1和豬P2引物[15](豬P1：5′-GTGTCTGCAGTACGTGTCCA-3′，豬P2：5′-TAGGATCCCTCACAGCGCATTTCTT-3′)，10 μL PremixTaq(TaKaRaTaqTMVersion 2.0 plus dye)加ddH2O至20 μL反應(yīng)體系。PCR擴(kuò)增體系為：94 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性30 s，64.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸 45 s，40個循環(huán)；72 ℃ 7 min終止延伸，4 ℃保存。

1.3 目的基因的克隆測序

PCR結(jié)束后，取5 μL產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收純化。將純化后的產(chǎn)物與與T克隆載體相連[pMD18-T vector，寶生物工程(大連)有限公司]，4 ℃過夜連接，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增。每個個體選取8～16個陽性克隆，送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將測序得到的DNA序列利用Bioedit V7.0.1和Clustal_X進(jìn)行編輯和對齊，切除完全相同的引物序列，把重復(fù)序列和假陽性序列剔除，從而確定等位基因類型及推導(dǎo)出等位基因型的氨基酸序列。將整理得到的DNA等位基因型用DNAsp 5.10.01分析其核苷酸多態(tài)性水平。登錄GenBank選取人、鼠相關(guān)物種的MHC基因序列與本試驗(yàn)得到豬的等位基因序列用Mega 6.0進(jìn)行建樹分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 血液基因組DNA

由圖1可見，提取得到的電泳圖條帶清晰，無明顯拖帶，可用作后續(xù)擴(kuò)增模板。

2.2 豬SLA Ⅱ-DRB第二外顯子的擴(kuò)增

擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示：條帶清晰，特異性強(qiáng)，片段大小接近245 bp。

2.3 測序結(jié)果分析

采取豬的樣本量共計20個個體，每個個體測序分別送樣15個陽性克隆，共得到300條序列，經(jīng)編輯整理合并重復(fù)序列后得到上下游引物完整的DNA序列共計133條(包含3條假基因序列)其中132條長度為245 bp，1條為246 bp。將所測得的序列在線Blast比對，圖3是其在NCBI中與其他豬SLAⅡ-DRB1基因第二外顯子的比對結(jié)果。經(jīng)檢測得到的序列與某豬(序列號：FJ169434.1)SLAⅡ-DRB1基因第二外顯子高度相似，證明所得序列是本試驗(yàn)需要的目的片段。

2.4 等位基因分析

參照慣例將得到的等位基因型命名為 SLA-DRB1*01 至SLA-DRB1*45。如表1所示豬20個個體(標(biāo)號A1、A2、B3等)的DNA等位基因型共整理得到45種。其中，標(biāo)號為SLA DRB1*08的等位基因分布范圍最廣，在19個個體中存在，其次為SLA DRB1*07，分布在16個個體中，還有大部分基因型是分布在單個個體中。在A1和A4個體檢測到等位基因型最多，為10種。

2.5 核苷酸和氨基酸多態(tài)性

本試驗(yàn)分析的45條等位基因序列，每條核苷酸序列198個位點(diǎn)，分析得到核苷酸多態(tài)位點(diǎn)共有102個，核苷酸多樣性水平為0.107 12，序列間的平均遺傳距離為0.118。經(jīng)翻譯得到相應(yīng)的DNA等位基因氨基酸序列，經(jīng)編輯整理后得到豬45條DNA等位基因序列的推導(dǎo)氨基酸序列(圖4)，每條序列均為66個氨基酸。

2.6 系統(tǒng)進(jìn)化分析

在GenBank選取人(GenBank登錄號：NM_001243965.1)與小鼠(GenBank登錄號：NM_207105.3)MHC基因序列同本試驗(yàn)得到的45條豬SLAⅡ-DRB1第二外顯子等位基因序列基于Kimura雙參數(shù)模型構(gòu)建N-J(Neighbor-Joining)系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)?？梢?，豬SLA-DRB1基因同人HLA-DRB1的親緣關(guān)系要比同小鼠H2-Ab1更近一些。

3 討論

SLA基因能夠影響MHC介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[16]以及動物的生產(chǎn)性狀[17]。目前，關(guān)于豬能夠作為生物學(xué)研究的理想大型動物模型的相關(guān)理論依據(jù)越來越多[18-20]，并且豬對于人的異種器官移植是一個良好的潛在供體[21]?？紤]到以上多種的發(fā)展可能，尋求一種快速、準(zhǔn)確、方便的方法以評估SLA多態(tài)性是很有必要的。有關(guān)SLA等位基因的分型方法多種多樣，目前主要包括PCR-直接測序分型法(PCR-SBT)、PCR-序列特異性引物(PCR-SSP)、PCR-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)及微衛(wèi)星標(biāo)記(MS)等。人們已經(jīng)使用這些方法從不同豬種和豬細(xì)胞系中鑒定了許多SLAⅠ類和Ⅱ等位基因和單倍型[22]。其中，PCR-SBT方法是將PCR擴(kuò)增得到的特定產(chǎn)物直接或克隆后進(jìn)行測序從而直觀地獲取堿基突變位置及突變類型，是當(dāng)前用來定義SLA特異性和多樣性的最直接和準(zhǔn)確的手段。

本研究采集同一種群的20頭成年長白豬，對其血液DNA的SLAⅡ-DRB1第二外顯子進(jìn)行PCR克隆測序。在DNA測序結(jié)果中，存在1個特殊長度的序列(246 bp)，且得到的全部DNA序列共存在3條假基因序列。說明DNA序列在PCR過程中可能存在缺失、插入、突變、移碼等過度修飾[23]。經(jīng)各種軟件編輯分析得到的DNA等位基因序列為45條，其中等位基因在個體分布范圍為1～19個不等，單個個體為1個基因型占66.7%，所占比例較高。這種情況的出現(xiàn)可能與樣本量有關(guān)，也可能是稀有等位基因的廣泛分布[24]。通過在線Blast與豬的SLAⅡ-DRB座位第二外顯子參考基因序列(GenBank登錄號：EU918422.1)進(jìn)行對照，可知得到的氨基酸序列是SLAⅡ-DRB第二外顯子編碼區(qū)的第4～69位。在對遺傳多態(tài)性分析中，得到多態(tài)性位點(diǎn)及多態(tài)性水平值均體現(xiàn)了豬SLA-DRB第二外顯子具有高度多態(tài)性。同人與小鼠MHC基因建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹中，可以發(fā)現(xiàn)與小鼠基因相比，人的基因貌似同豬SLA-DRB基因親緣關(guān)系更近，但它們同豬均屬于不同分支，豬同其他物種MHC基因的親緣關(guān)系仍需進(jìn)一步探究。

表1 豬20個個體的等位基因分布

注：·表示個體存在該等位基因。

目前，MHC分子在人類免疫調(diào)節(jié)、器官移植和自身免疫疾病中起到的作用已經(jīng)受到廣泛關(guān)注。隨著實(shí)驗(yàn)動物模型的不斷開發(fā)能夠推進(jìn)有關(guān)MHC各個方面的生物學(xué)研究。有關(guān)豬MHC的研究顯示SLA分子對于部分免疫疾病具有一定的指導(dǎo)意義，比如豬腹瀉[25-26]、口蹄疫病毒[27]、皮膚惡性黑色素瘤[28]、豬繁殖與呼吸綜合征病毒[29]、豬偽狂犬病病毒等[30]。本研究旨在對豬的SLAⅡ-DRB1座位第二外顯子進(jìn)行多態(tài)性分析，從多個方面闡述了該基因的高度多態(tài)性特征，為后期的豬血液微生物多態(tài)性分析試驗(yàn)做鋪墊以探索新的抗豬病原體等位基因，從而為SLA分子相關(guān)免疫研究提供理論依據(jù)。