李紅敏，楊海軍，代寧濤，周福有

(1.河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003；2.安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院，河南 安陽(yáng) 455000)

食管鱗癌是影響我國(guó)人民身體健康的重要惡性腫瘤之一，流行病學(xué)調(diào)查顯示，食管鱗癌發(fā)病率位于我國(guó)常見腫瘤第6位，死亡率位于第4位，男性發(fā)病率高于女性，農(nóng)村高于城市[1]。我國(guó)食管鱗癌發(fā)病呈明顯地域趨勢(shì)，高發(fā)區(qū)發(fā)病率顯著高于周邊地區(qū)，在太行山沿線地區(qū)，特別是在豫北地區(qū)的林州市(林縣)及其毗鄰地區(qū)，食管鱗癌和賁門癌發(fā)病率占當(dāng)?shù)厮心[瘤發(fā)病率的81%,發(fā)病率顯著高于相應(yīng)省份。食管鱗癌早期臨床癥狀不明顯，發(fā)病隱匿，就診時(shí)多已是中晚期，預(yù)后差，5 a生存率低。

程序性死亡受體1(programmed cell death 1，PD-1)又名CD279，屬于超蛋白CD28家族成員之一，共有268個(gè)氨基酸組成，表達(dá)于T淋巴細(xì)胞的膜表面，與程序性死亡受體配體1(programmed cell death ligand 1，PD-L1)結(jié)合可以抑制T淋巴細(xì)胞活化，介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸。在胃癌、非小細(xì)胞肺癌、大腸癌和黑色素瘤等多種腫瘤的發(fā)生過程中均可以檢測(cè)到PD-1、PD-L1的高表達(dá)[2-5]，并提示預(yù)后較差。但在小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)PD-1、PD-L1提示預(yù)后較好[6]。本研究通過檢測(cè)食管鱗癌組織中PD-1、PD-L1的表達(dá)情況，以期了解該通路與食管鱗癌發(fā)生的關(guān)系。為尋找食管鱗癌新的治療方法和方向提供一定理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1一般資料選取安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院2016年7月至2017年6月間胃鏡活檢結(jié)果為正常的患者50例；食管不典型增生49例；術(shù)前未進(jìn)行放、化療及免疫治療，未合并其他腫瘤和消化道疾病，術(shù)后病理確診為食管鱗癌患者49例。所有入組對(duì)象均簽署患者科研知情同意書，提交安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)倫理審查，審查通過后正式入組。其中食管不典型增生患者中，男30例，年齡51～77(59±5.5)歲；女19例，年齡49～76(61±5.5)歲。食管鱗癌患者中，男28例，年齡51～79(60±5.5)歲；女21例，49～77(62±5.5)歲。

1.2免疫組化染色采用免疫組化S-P法檢測(cè)不同食管組織中PD-1和PD-L1，PD-1羊抗人單克隆抗體按照說明書150稀釋離心(稀釋液為蒸餾水)。PD-L1羊抗人單克隆抗體按照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果1300稀釋離心(稀釋液為自制蒸餾水)，二抗即用型，均購(gòu)自北京中杉金橋生物工程有限公司。組織蠟塊經(jīng)3 μm連續(xù)切片，烤片后脫蠟、水化；檸檬酸修復(fù)液加熱2 min抗原修復(fù)；逐步滴加阻斷液過氧化物酶(避光10 min)，正常非免疫動(dòng)物血清封閉(室溫孵育10 min)，一抗(4 ℃ 過夜)，二抗(37 ℃孵育30 min)，鏈霉菌抗生物素—過氧化物酶溶液(室溫10 min)，DAB顯色。鏡下控制顯色程度，水洗、復(fù)染、返藍(lán)，脫水后中性樹膠封片，鏡檢。

1.3結(jié)果判定PD-1、PD-L1陽(yáng)性結(jié)果判定參考Bukholm等[7]制定的標(biāo)準(zhǔn)，由2位本院病理學(xué)專家采用雙盲法觀察切片，半定量法計(jì)算結(jié)果，每例隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野(×400)，共計(jì)數(shù)200個(gè)需觀察目標(biāo)細(xì)胞，計(jì)數(shù)總數(shù)及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。染色強(qiáng)度:無色為0分，黃色為1分，黃褐色為2分，深褐色為3分。將2項(xiàng)積分相乘，0分為陰性(-)，1～4分為弱陽(yáng)性(+)，5～8分為中等陽(yáng)性(++)，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，其中后三者均記為陽(yáng)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)，兩變量之間的相關(guān)性采用Spearman分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1不同食管組織中PD-1、PD-L1表達(dá)的比較PD-1表達(dá)于浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜上，部分細(xì)胞質(zhì)中可見，PD-L1主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞和部分間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中(圖1、2)。食管鱗癌組織中PD-1蛋白陽(yáng)性率高于正常食管黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；食管鱗癌組織中PD-L1蛋白陽(yáng)性率高于食管不典型增生和正常食管黏膜組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05，表1)。

圖1　正常食管黏膜(A)、食管不典型增生(B)和食管鱗癌(C)組織中PD-1的表達(dá)(S-P，×400)

圖2　正常食管黏膜(A)、食管不典型增生(B)和食管鱗癌(C)組織中PD-L1的表達(dá)(S-P，×400)

組織類型nPD-1陽(yáng)性率/%PD-L1陽(yáng)性率/%正常食管黏膜5018.020.0食管不典型增生4922.422.4食管鱗癌4936.749.0

2.2PD-1、PD-L1在食管鱗癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系PD-L1的表達(dá)與食管鱗癌患者腫瘤浸潤(rùn)層次及TNM分期有關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2　PD-1、PD-L1在食管鱗癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系　n(%)

2.3食管鱗癌組織中PD-1、PD-L1表達(dá)的相關(guān)性PD-1和PD-L1在食管鱗癌組織中的表達(dá)無明顯相關(guān)性(P>0.05)。見表3。

表3　食管鱗癌組織中PD-1和PD-L1表達(dá)的相關(guān)性　n

3　討論

T淋巴細(xì)胞可以通過白介素家族成員等誘導(dǎo)PD-1激活，激活的PD-1與其配體PD-L1結(jié)合后抑制腫瘤免疫微環(huán)境，并負(fù)調(diào)控T淋巴細(xì)胞的活性和增殖能力，從而降低T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫殺傷，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。這是因?yàn)镻D-1是T淋巴細(xì)胞上的共抑制因子之一，與其配體PD-L1結(jié)合后細(xì)胞質(zhì)區(qū)免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序結(jié)構(gòu)域上的酪氨酸發(fā)生磷酸化，并通過遏制抗細(xì)胞凋亡因子Bcl-XL的表達(dá)下調(diào)白介素-2和葡萄糖代謝，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞功能失活，負(fù)調(diào)控細(xì)胞免疫功能。因此PD-1、PD-L1的過表達(dá)可以使多種腫瘤預(yù)后變差。PD-L1是PD-1的配體之一，由PD-L1基因編碼，位于9號(hào)染色體p24.1上。PD-1、PD-1通路在正常生理情況下可以維持人體自身的免疫耐受，防止過度炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生，但是在病理情況下，PD-1、PD-L1在腫瘤免疫逃逸方面起到了重要作用。

我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，PD-1蛋白表達(dá)于T淋巴細(xì)胞和部分上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上，正常食管黏膜和食管不典型增生組織中的表達(dá)水平差異不明顯。在食管鱗癌組織中PD-1陽(yáng)性率要顯著高于正常食管黏膜，但與食管不典型增生組織無明顯差異。PD-1在食管鱗癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征也無明顯相關(guān)性。Kim等[8]研究認(rèn)為PD-1的表達(dá)和食管鱗癌臨床病理特征和預(yù)后無明顯相關(guān)性，這與本研究結(jié)果一致，因此我們考慮PD-1在食管癌進(jìn)展期作用可能更加明顯。但Feng等[9]認(rèn)為PD-1在食管不典型增生組和正常食管組中陽(yáng)性率差異也較明顯，癌變組顯著高于正常食管組和食管不典型增生組，這與本研究結(jié)果并不一致。PD-L1表達(dá)在腫瘤細(xì)胞和部分間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，少數(shù)腺體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中也有表達(dá)，正常食管組和食管不典型增生組比較陽(yáng)性率無顯著差異。PD-L1在食管鱗癌組織中表達(dá)要明顯高于正常食管組和食管不典型增生組。本研究證實(shí)PD-L1與食管鱗癌浸潤(rùn)層次和TNM分期有顯著相關(guān)性(P<0.05)這與課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，也與Chen等[10]的研究結(jié)果一致。提示PD-L1表達(dá)失衡可能是導(dǎo)致食管癌發(fā)生的因素之一。

本研究認(rèn)為PD-L1可能是介導(dǎo)食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)重要因素。因此阻斷PD-1/PD-L1通路，恢復(fù)T淋巴細(xì)胞免疫監(jiān)視功能，將會(huì)是食管鱗癌免疫治療的新靶點(diǎn)，并會(huì)為食管鱗癌治療提供新的方向。