劉艷霞，秦貴軍，朱貝貝

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，河南 鄭州 450052)

甲狀腺癌是最常見(jiàn)內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病原因并不明確，也是人類死亡率較高的惡性腫瘤之一。由于缺乏對(duì)甲狀腺癌早期癥狀特異和敏感的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，且大多數(shù)患者沒(méi)有明確的臨床癥狀，發(fā)現(xiàn)時(shí)已被診斷為甲狀腺癌晚期，其生存時(shí)間通常很短[1-2]。甲狀腺癌的治療方案通常為手術(shù)并輔助內(nèi)分泌藥物和放、化療聯(lián)合治療。盡管近年來(lái)甲狀腺癌患者的生存有所改善，但大多數(shù)甲狀腺癌患者預(yù)后仍然很差[3]。因此，找到合適的甲狀腺癌生物標(biāo)志物檢測(cè)指標(biāo)可能是改善患者治療效果的關(guān)鍵。

微小核糖核酸(micro ribonucleic acid，miR)是一類長(zhǎng)度為17～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，可通過(guò)抑制靶mRNA在生物活動(dòng)中發(fā)揮作用[4]。MiR-146a是一種與腫瘤相關(guān)的miR，在多種腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的侵襲、增殖和凋亡等均相關(guān)，但其具體的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步的探索[5-6]。通過(guò)生物信息預(yù)測(cè)網(wǎng)站查找發(fā)現(xiàn)miR-146a可靶向CXC型趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)的3’-非翻譯區(qū)。CXCX4是一種趨化因子，也是G蛋白偶聯(lián)受體，在甲狀腺癌及其他多種惡性腫瘤中高表達(dá)，并通過(guò)進(jìn)一步激活其下游的信號(hào)通路來(lái)影響惡性腫瘤的炎癥、侵襲、凋亡等[7-9]。目前，miR-146a是否可以通過(guò)調(diào)控CXCR4的表達(dá)影響甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲能力還有待研究。本研究以甲狀腺癌SW579細(xì)胞作為研究對(duì)象，探討miR-146a是否可以通過(guò)抑制CXCR4的表達(dá)影響SW579細(xì)胞侵襲能力，為深入研究甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制提供有力的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞株和試劑人類甲狀腺癌細(xì)胞株SW579(中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù))；RPMI-1640培養(yǎng)基(北京索萊寶公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；脂質(zhì)體Lipofectamine2000(美國(guó)Invitrogen公司)；qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green熒光染料試劑盒(日本Toyobo公司)，兔抗人CXCR4單克隆抗體和兔抗人β-acitn單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)；Transwell基質(zhì)膠(美國(guó)BD公司)；陰性對(duì)照、miR-146a mimics均由上海吉瑪生物公司合成。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)SW579細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640完全培養(yǎng)基中(含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 u·mL-1青霉素、100 g·mL-1鏈霉素)，并置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，等到細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時(shí)進(jìn)行傳代，或用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)將處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SW579細(xì)胞接種到六孔板中，每孔1.5×105個(gè)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。嚴(yán)格按照Lipofectamine2000試劑說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，根據(jù)目的基因分為：空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-34a mimics組。

1.4實(shí)時(shí)定量PCR按照Trizol法處理轉(zhuǎn)染24 h后各組細(xì)胞，提取總RNA，并嚴(yán)格按照qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和SYBR Green熒光染料試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列為(5'～3')：miR-146a-F： CAGTGCGTGTCGTGGAGT，miR-146a-R：GGTGAGAACTGAATTCCA；CXCR4-F：ACTACACCGAGGAAATGGGCT，CXCR4-R： CCCACAATGCCAGTTAAGAAGA。miR-146a的內(nèi)參采用U6，CXCR4的內(nèi)參選用β-actin，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以2-△△Ct法計(jì)算miR-146a和CXCR4的相對(duì)表達(dá)量。

1.5Westernblot嚴(yán)格按照RIPA蛋白裂解液說(shuō)明書提取各組總蛋白，并用BCA定量法測(cè)定各組蛋白的濃度。每孔取25 μg總蛋白進(jìn)行電泳；用半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%牛血清白蛋白封閉1 h，然后分別加入CXCR4(1500)和β-actin(11 000)單克隆抗體，放入冰箱4 ℃孵育過(guò)夜；棄去一抗，加入二抗(11 000)孵育2 h。用超靈敏度化學(xué)發(fā)光液顯色，條帶以灰度值表示，采用Image J軟件對(duì)各組條帶進(jìn)行分析。CXCR4蛋白的相對(duì)表達(dá)量以CXCR4與β-actin的灰度值比值表示。

1.6Transwell實(shí)驗(yàn)先對(duì)Transwell小室和24孔板進(jìn)行平衡：分別在上室加100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基，下室加750 μL完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2環(huán)境下過(guò)夜。接著將饑餓處理的SW579細(xì)胞按照每孔2×104個(gè)細(xì)胞接種到上室，繼續(xù)放在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的環(huán)境下培養(yǎng)36 h。然后擦除上室細(xì)胞，用甲醇將小室膜下室側(cè)的細(xì)胞固定，蘇木素染色后進(jìn)行拍照，高倍鏡下取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，取其平均值作為侵襲細(xì)胞數(shù)。

2　結(jié)果

2.1SW579細(xì)胞miR-146amimics的轉(zhuǎn)染效率實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，miR-146a mimics組(4.12±0.25)的miR-146a相對(duì)表達(dá)量明顯高于陰性對(duì)照組(1.06±0.17)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2MiR-146amimics對(duì)SW579細(xì)胞CXCR4mRNA和蛋白的影響與空白對(duì)照組(1.00、1.93±0.07)和陰性對(duì)照組(0.92±0.05、1.85±0.06)比較，miR-146a mimics組(0.39±0.11、1.03±0.03)CXCR4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組CXCR4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1、圖1。

表1　MiR-146a mimics對(duì)SW579細(xì)胞CXCR4 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

注：與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，1)P<0.05

圖1　MiR-146a mimics對(duì)SW579細(xì)胞CXCR4蛋白表達(dá)的影響

2.3MiR-146amimics對(duì)SW579細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-146a mimics組(25.36±4.65)與空白對(duì)照組(60.95±2.41)和陰性對(duì)照組(53.83±3.92)比較，SW579細(xì)胞的侵襲能力降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組侵襲能力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

表2　MiR-146a mimics對(duì)SW579細(xì)胞侵襲能力的影響

注：與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，1)P<0.05

圖2　MiR-146a mimics對(duì)SW579細(xì)胞侵襲能力的影響

3　討論

甲狀腺癌是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌惡性腫瘤之一，隨著人類壽命的延長(zhǎng)和環(huán)境污染的加重，甲狀腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì)。甲狀腺癌在臨床上首選手術(shù)切除治療，然后再輔助內(nèi)分泌藥物和放、化療等治療方法。由于甲狀腺癌發(fā)現(xiàn)時(shí)大多數(shù)已處于晚期，術(shù)后仍有很高的復(fù)發(fā)率，且預(yù)后也很差，對(duì)患者的生活有很大影響。因此，現(xiàn)在臨床急需找到能早期診斷甲狀腺癌的檢測(cè)方法和有較好療效的治療手段。

研究[10-12]表明，miR的異常表達(dá)與人類的許多疾病密切相關(guān)，包括惡性腫瘤、心血管疾病和炎癥等。目前很多研究發(fā)現(xiàn)miR-146a在甲狀腺癌中有顯著的差異性表達(dá)，即miR-146a呈低表達(dá)。MiR-146a是腫瘤抑制基因，位于人類5q33號(hào)染色體上，在乳腺癌、胃癌和肝癌等惡性腫瘤中表達(dá)降低，并發(fā)揮作用[5,13]。MiR-146a可能是通過(guò)調(diào)節(jié)CXCR4的表達(dá)，控制下游的信號(hào)通路，影響甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲能力。MiR-146a可以通過(guò)抑制其靶基因影響甲狀腺癌的多種生物學(xué)行為，但miR-146a對(duì)甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制的具體影響仍需要進(jìn)一步探討。本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-146a可抑制SW579細(xì)胞的侵襲能力；而且，本研究通過(guò)生物信息預(yù)測(cè)網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)CXCR4是miR-146a的作用基因之一，并且Bhaumik等[14]已在乳腺癌中進(jìn)行了驗(yàn)證。CXCR4是一種重要的蛋白受體，位于人類2q21號(hào)染色體上，可表達(dá)在多種細(xì)胞上進(jìn)而發(fā)揮作用。目前，CXCR4在腫瘤治療中的作用越來(lái)越受到重視，Wong等[15]研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4在甲狀腺癌、甲狀腺瘤和甲狀腺腫等疾病中均有表達(dá)且其陽(yáng)性率呈逐漸下降的趨勢(shì)。但是，miRNA-146a是否通過(guò)調(diào)節(jié)CXCR4的表達(dá)來(lái)抑制SW579細(xì)胞侵襲功能，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-146a還可以抑制CXCR4 mRNA和蛋白在SW579細(xì)胞中的表達(dá)。因此，miR-34a可能通過(guò)靶向抑制CXCR4的表達(dá)來(lái)影響SW579細(xì)胞的侵襲能力。

綜上所述，本研究從細(xì)胞水平闡明了miR-146a和CXCR4可能參與甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制，miR-146a可能通過(guò)靶向調(diào)節(jié)CXCR4的表達(dá)抑制甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲能力，影響甲狀腺癌細(xì)胞的生物學(xué)特性，進(jìn)而促進(jìn)甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展，也為臨床甲狀腺癌的治療提供了一個(gè)可行的研究思路。