梁麗薇， 高 鵬， 羅 俊， 黃 群， 高曉黎

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊 830054； 2新疆新姿源生物制藥有限責(zé)任公司， 新疆 伊犁 835803)

倍美力片Premarin○RTablets由美國輝瑞(惠氏)公司獨家生產(chǎn)，于1942年在美國FDA批準(zhǔn)上市，主要通過補充外源性雌激素來緩解因雌激素不足而產(chǎn)生的臨床癥狀[1]，多用于治療女性更年期綜合癥[2-3]、骨質(zhì)疏松癥[4-6]、中-重度與絕經(jīng)相關(guān)的血管舒縮癥狀[7-9]，及雌激素缺乏相關(guān)的各種疾病，是更年期婦女雌激素補充療法的重要藥物[10]。倍美力片主成分結(jié)合雌激素(Conjugated Estrogens，CE)來源于生物樣品，成分復(fù)雜多樣，美國藥典對CE中10種組分[雌酮(Estrone)、馬烯雌酮(Equilin)、17α-雌二醇(17α-Estradiol)、17β-雌二醇(17β-Estradiol)、17α-雙氫馬烯雌酮(17α-Dihydroequilin)、17β-雙氫馬烯雌酮(17β-Dihydroequilin)、17α-雙氫馬萘雌酮(17α-Dihydroequilenin)、17β-雙氫馬萘雌酮(17β-Dihydroequilenin)、馬萘雌酮(Equilenin)、△8,9-脫氫雌酮(△8,9-Dihydroestrone)]的含量進行了控制[11]。國外學(xué)者采用薄層色譜法(TLC)、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、液-質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)及氣-質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)等技術(shù)對倍美力片中CE組分進行分析研究[12-13]，美國FDA采用LC-MS法測定并分析了倍美力片中的60種甾體成分[14]，但對其已知10種CE組分的研究鮮有報道。美國藥典采用GC法對CE原料藥進行質(zhì)量控制，而并未包括倍美力片中的CE組分，因此建立倍美力片中10種CE組分的研究方法對于CE藥物的質(zhì)量控制及臨床應(yīng)用等方面的研究極為重要，本研究基于美國藥典建立了GC-FID法測定倍美力片中10種CE組分含量的檢測方法，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器Agilent-7890A型氣相色譜儀及工作站(美國安捷倫科技有限公司)，AB-265S型分析天平(梅特勒-托利多公司)，SHZ-C型水浴恒溫振蕩器(上海博訊實業(yè)有限公司)，SB5200D型超聲波清洗器(寧波新芝科技公司)，TDL-4A型臺式低速離心機(上海菲恰爾分析儀器有限公司)，UGC-12T型氮氣吹掃儀(北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司)，SK-1型快速混勻器(江蘇大唐醫(yī)療器械有限公司)。

1.2試藥倍美力片(美國惠氏艾爾斯特制藥公司，批號M26157、N60543，規(guī)格0.625 mg/片)，雌酮對照品(USP，純度99.9%，批號LOF119)，馬烯雌酮對照品(USP，純度100.0%，批號R030G0)，17α-雙氫馬烯雌酮對照品(USP，純度99.0%，批號J1L148)，甲苯(天津北聯(lián)精細化學(xué)品開發(fā)有限公司，批號20151020)，3-O甲基雌酮(TLC，批號1250-075A1)，1%三甲基氯硅烷的二(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(美國SIGMA公司，批號BCBR7240V)，硫酸酯酶(美國SIGMA公司，批號SLBQ7945V)，醋酸鈉(天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號20140804)，無水乙醇(天津永晟精細化工有限公司，批號20120705)，醋酸(天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號20120720)，氯化鋇(天津永晟精細化工有限公司，批號20110726)，無水硫酸鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號2014101)，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1pH5.2醋酸鹽緩沖溶液的制備取1 mol/L醋酸鈉溶液(稱取醋酸鈉13.6 g，用水稀釋至100 mL)∶1 mol/L醋酸溶液∶水(79∶21∶400)，混勻，用1 mol/L醋酸溶液調(diào)節(jié)pH(5.2±0.1)，即得，備用。

2.2內(nèi)標(biāo)溶液的制備稱取內(nèi)標(biāo)物3-O-甲基雌酮15 mg，置于100 mL容量瓶中，用甲醇超聲溶解，放置室溫，用甲醇定容成濃度為150 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的制備稱取17α-雙氫馬烯雌酮標(biāo)準(zhǔn)品10 mg、馬烯雌酮標(biāo)準(zhǔn)品14 mg、雌酮標(biāo)準(zhǔn)品32 mg，置于200 mL容量瓶中，用無水乙醇超聲溶解，放至室溫，用無水乙醇定容成濃度分別為50、70、160 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

2.4供試品溶液的制備取倍美力片20片，除去包衣層，研細，稱取倍美力片粉末約2 mg置于50 mL具塞離心管中，加pH5.2的緩沖溶液15 mL，加氯化鋇1 g，密塞，25℃水浴振搖30 min后，超聲30 s，25℃水浴再振搖30 min，加入2500單位硫酸酯酶溶液，在50℃水浴中振搖20 min，趁熱加入二氯乙烷15 mL，密塞，40℃水浴中振搖15 min，4 000 r/min離心10 min，直至下層溶液澄清，取下層溶液經(jīng)干燥脫酯棉及無水硫酸鈉5 g快速濾過得澄清濾液，避免揮發(fā)損失，吸取此濾液3 mL、內(nèi)標(biāo)溶液1 mL置于5 mL具塞離心管中，搖勻，用氮氣吹干。殘渣加入無水吡啶15 μL及含1%三甲基氯硅烷的二(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺65 μL，密塞，混勻，放置15 min，加甲苯0.5 mL，混勻，即得供試品溶液。

2.5系統(tǒng)適用性溶液的制備稱取17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于100 mL容量瓶中，用無水乙醇超聲溶解，放至室溫，用無水乙醇定容，搖勻，吸取1 mL置于50 mL容量瓶中，用無水乙醇定容成濃度為2 μg/mL的溶液，搖勻。吸取1 mL置于5 mL具塞離心管中，加入標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1 mL及內(nèi)標(biāo)液1 mL，搖勻，按“2.4”項下方法制備，即得系統(tǒng)適用性溶液。

2.6對照品溶液的制備吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1 mL、內(nèi)標(biāo)溶液1 mL至于5 mL具塞離心管中，搖勻，按“2.4”項下方法制備，即得對照品溶液。

2.7色譜條件RTX-225石英毛細管色譜柱(15 m×0.25 mm×0.25 μm)，F(xiàn)ID檢測器，載氣為N2，柱溫為208℃，進樣口溫度為260℃，檢測器溫度為260℃，程序升溫，柱流量為2.0 mL/min，分流比為28∶1，進樣量為1 μL，分析時間為35 min。

2.8方法學(xué)考察

2.8.1 專屬性實驗 按“2.7”項下色譜條件分別對內(nèi)標(biāo)溶液、對照品溶液、系統(tǒng)適用性溶液及供試品溶液進行分析，17β-雌二醇、17α-雙氫馬烯雌酮、雌酮、馬烯雌酮相對于3-O甲基雌酮的相對保留時間分別為0.28、0.29、0.78、0.81 min，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)對10種結(jié)合雌激素組分檢測無干擾，各組分分離度良好，見圖1。

a: 內(nèi)標(biāo)溶液

b: 對照品溶液

c: 系統(tǒng)適用性溶液

d: 供試品溶液

圖1倍美力片GC色譜圖

2.8.2 回歸方程的建立 吸取“2.3”項下標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液50 mL置于200 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，搖勻，作為線性儲備溶液。分別吸取線性儲備溶液0.4、0.8、2.0、3.2、4.0、4.8、6.0 mL置于5 mL具塞離心管中，按“2.4”項下方法制備，即得線性溶液，分別吸取1 μL，按“2.7”項下色譜條件分析。以3組分(雌酮、馬烯雌酮、17α-雙氫馬烯雌酮)對照品與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)(Y)，3種組分的濃度為橫坐標(biāo)(X)進行線性回歸，結(jié)果雌酮在2.39～478.47 μg/mL、馬烯雌酮在2.45～210.03 μg/mL、17α-雙氫馬烯雌酮在0.74～148.05 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表1。

表1 主成分線性結(jié)果

2.8.3 精密度實驗 吸取“2.6”項下對照品溶液1 μL，按“2.7”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，測得雌酮峰面積分別為170.9、173.4、174.1、174.8、175.7、175.3，與內(nèi)標(biāo)峰的比值分別為1.28、1.29、1.29、1.29、1.29、1.30、1.30，RSD為0.4%，表明方法精密度良好。

2.8.4 重復(fù)性實驗 取倍美力片，按“2.4”項下方法制備6份供試品溶液，按“2.7”項下色譜條件分析，雌酮硫酸鈉(sodium estrone sulfate，Es)含量的RSD值為0.6%，馬烯雌酮硫酸鈉(sodium equilin sulfate，Eqs)含量的RSD值為1.5%，雌酮硫酸鈉與馬烯雌酮硫酸鈉之和(Es+Eqs)含量的RSD值為0.8%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8.5 準(zhǔn)確度實驗 稱取“2.4”項下供試品粉末約2 mg置于50 mL離心管中，分別相當(dāng)于目標(biāo)濃度為100%的供試品溶液濃度的80%、100%、120%，每個濃度分別配制3份平行樣品，共9份溶液，分別加入15 mL pH5.2的醋酸鹽緩沖溶液，按“2.4”項下方法制備，即得3個濃度的準(zhǔn)確度溶液。按“2.7”項下色譜條件分析，計算回收率。3個濃度下Es、Eqs、Es+Eqs含量的平均回收率分別為99.6%、100.2%、99.9%，3個濃度下回收率的RSD分別為1.4%、0.9%、1.1%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.8.6 穩(wěn)定性實驗 取“2.4”項下制備的供試品溶液，分別于0、12、24、36、48、60、72 h按“2.7”項下色譜條件分析。測得供試品溶液中Es、Eqs及Es+Eqs含量的RSD均<2.0%，表明供試品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9樣品測定取2批倍美力片，按“2.4”項下方法制備，按“2.7”項下色譜條件測定10種CE組分含量，倍美力片中雌酮硫酸鈉標(biāo)示含量為54.90%～56.60%，馬烯雌酮硫酸鈉標(biāo)示含量為25.80%～25.90%，17α-雌二醇硫酸鈉標(biāo)示含量為3.56%～3.67%，17β-雌二醇硫酸鈉標(biāo)示含量為1.20%～1.23%，17α-雙氫馬烯雌酮硫酸鈉標(biāo)示含量為14.66%～15.25%，17β-雙氫馬烯雌酮硫酸鈉標(biāo)示含量為1.42%～1.52%，17α-雙氫馬萘雌酮硫酸鈉標(biāo)示含量為1.75%～1.81%、17β-雙氫馬萘雌酮硫酸鈉標(biāo)示含量為0.24%～0.26%，△8,9脫氫雌酮硫酸鈉標(biāo)示含量為3.89%～3.96%，馬萘雌酮硫酸鈉標(biāo)示含量為1.95%～2.02%，見表2、3。

表2 倍美力片中2種主成分含量測定結(jié)果

表3 倍美力片中8種CE組分含量測定結(jié)果

3 討論

3.1樣品處理方法倍美力片為糖衣骨架型，在進行含量測定前需用蒸餾水洗去片體外表面的色素衣和糖衣層，是實驗中的難點，若洗的時間過長，會導(dǎo)致主成分流失，含量測定結(jié)果偏低，因此洗片時要少量多次，且不超過15 s，因倍美力片粉末易出現(xiàn)成團現(xiàn)象，影響結(jié)果測定，因此實驗稱量前應(yīng)研磨充分，保證結(jié)果穩(wěn)定。

3.2GC-FID法本文參照美國藥典CE原料藥專論檢測方法，建立GC-FID法測定倍美力片中10種CE組分的含量，完成方法學(xué)考察，測定2批倍美力片中十種CE組分的標(biāo)示含量，按美國藥典CE原料藥專論標(biāo)準(zhǔn)分析，結(jié)果表明倍美力片中10種CE組分含量均符合規(guī)定，2批倍美力片含量測定結(jié)果相似，說明倍美力片制劑工藝成熟穩(wěn)定，分析方法準(zhǔn)確度、靈敏度高，穩(wěn)定可靠，可作為CE產(chǎn)品的測定方法，從而更好的評價和控制CE片的質(zhì)量。