王 甜， 鄭雪婷， 齊文靜， 何 黎， 張文寶， 李琳琳， 李 軍

(新疆醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011； 2第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院， 烏魯木齊 830054)

包蟲病是呈全球性分布的一種人獸共患病，有兩種分型,分別是由細(xì)粒棘球絳蟲(E.granulosus, E.g)感染所致的囊型包蟲病(Cystis Echinococcosis, CE)和多房棘球絳蟲(E.multilocularis, E.m)感染所致的泡型包蟲病(Alveolar echinococcosis, AE)。細(xì)粒棘球絳蟲寄生于人、家畜和嚙齒動(dòng)物的肝、肺等實(shí)質(zhì)器官內(nèi)[1]，對(duì)人身體健康和畜牧經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重影響[2]。實(shí)驗(yàn)室研究用原頭蚴通常采集于自然感染綿羊或包蟲病患者病灶內(nèi)[3]，但受季節(jié)、畜牧屠宰量等各種因素限制。首先包蟲病呈現(xiàn)地理分布，主要分布在我國新疆和內(nèi)蒙古高原、青藏高原、陜甘中黃土高原等[4-5]，因此其它地區(qū)研究材料匱乏。其次，采集于不同地點(diǎn)、時(shí)間、季節(jié)等自然感染的羊肝，收集的原頭蚴總量及活力完全不同，因此在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)獲得原頭蚴，體外培養(yǎng)成微囊注射到小鼠體內(nèi)獲得原頭蚴，完成實(shí)驗(yàn)室內(nèi)原頭蚴→原頭蚴的循環(huán)至關(guān)重要。本研究采用高感染率的腹腔注射微囊法感染BALB/c小鼠[6]，通過解剖不同感染時(shí)期小鼠，確定生長發(fā)育出細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴的可育囊時(shí)間，為今后包蟲病的生物學(xué)及醫(yī)學(xué)研究提供保障。

1 材料方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雌性BALB/c小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，SPF級(jí)，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2主要儀器與試劑離心機(jī)(Centrifuge 5424R型)購于德國eppendorf公司，酶標(biāo)儀(MULTISKAN SPECTRUM型)和CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(series 8000 DH型)購于Thermo公司，生物安全柜(HFsafe-1200B2型)購于中國Heal Force公司，D-Hank′s緩沖液(SH30031.02)、胎牛血清(SV30087.02)、磷酸緩沖鹽溶液、青/鏈霉素溶液(SV30010)、RPMI-1640培養(yǎng)基(SH30809.01)購于美國Hyclone公司，多聚甲醛(P6145)、胃蛋白酶(P7000)、亞甲基藍(lán)購于德國Sigma-Aldric公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(23227)購于美國Thermo公司，羊抗鼠IgG購于美國BETHYL公司。

1.3細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴的制備及體外微囊的培養(yǎng)取自然感染的綿羊肝臟或肺臟，采集細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴。用1%胃蛋白酶(pH 2.0)37℃消化30 min，用含有雙抗的PBS在無菌條件下漂洗3～5遍后，亞甲基藍(lán)檢測(cè)活力>95%，用含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，于37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，體外培養(yǎng)約2個(gè)月，即可獲得直徑約200～300 μm的細(xì)粒細(xì)粒棘球絳蟲微囊[6]。

1.4細(xì)粒棘球絳蟲微囊感染BALB/c小鼠將BALB/c小鼠80只，根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為正常飼養(yǎng)組(3、6、9、12個(gè)月)、細(xì)粒棘球絳蟲感染組(3、6、9、12個(gè)月)，感染組用無菌PBS(含1%雙抗)漂洗培養(yǎng)得到的細(xì)粒棘球絳蟲微囊3～5遍，以每只鼠35個(gè)微囊的量，采用腹腔注射的途徑接種于BALB/c小鼠體內(nèi)，建立細(xì)粒棘球絳蟲感染小鼠模型[6]。

1.5細(xì)粒棘球絳蟲感染小鼠處理

1.5.1 剖殺感染小鼠 分別在感染后第3、6、9、12個(gè)月稱重，采血，剖殺小鼠，觀察小鼠腹腔內(nèi)包囊生長情況，細(xì)查包囊寄生部位和包囊數(shù)量及外觀形態(tài)。取出包囊用PBS漂洗，用濾紙吸干囊外壁水分，刺破包囊，收集囊液，光學(xué)顯微鏡下觀察囊液沉淀物中是否有原頭蚴，并在光學(xué)顯微鏡下拍照、記錄原頭蚴狀態(tài)。

1.5.2 小鼠感染模型組織學(xué)鑒定 取完整包囊，PBS漂洗3～5次，用4%的多聚甲醛固定。包囊經(jīng)過伊紅預(yù)染色3 h、梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片、蘇木素—伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察包囊結(jié)構(gòu)，拍照測(cè)量包囊角質(zhì)層厚度。

1.5.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)小鼠血清抗體變化 收集羊源細(xì)粒棘球絳蟲囊液，離心，濃縮上清。用BCA試劑盒測(cè)定羊囊液蛋白含量為1.2 mg/mL，以5 μg/mL孔的濃度包被到96 孔酶標(biāo)板上，小鼠血清濃度1∶100，酶標(biāo)物為羊抗鼠IgG，工作濃度為1∶5 000。底物顯色劑為ABTS，以樣品孔與陰性孔血清的光密度(OD 405 nm)比值大于3(P/N≥3)為陽性，反之為陰性[7]。

2 結(jié)果

2.1BALB/c小鼠繼發(fā)感染模型不同時(shí)間段解剖觀察在觀察感染細(xì)粒棘球絳蟲微囊不同時(shí)間段小鼠發(fā)現(xiàn)，感染早期小鼠體質(zhì)量、形態(tài)無明顯變化，但隨感染時(shí)間的增長小鼠腹部隆起愈加明顯，感染3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月小鼠體質(zhì)量與同批正常組小鼠體質(zhì)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但感染12個(gè)月小鼠體質(zhì)量增長至(32.76±3.76) g，飼養(yǎng)12個(gè)月小鼠體質(zhì)量為(27.20±1.21) g，與正常組小鼠體質(zhì)量比較明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1。

解剖發(fā)現(xiàn)感染細(xì)粒棘球絳蟲微囊3個(gè)月的10只小鼠腹腔內(nèi)包囊數(shù)量不等，包囊多游離于腹腔，但有少量包囊鑲嵌于肝臟表面，10只小鼠共計(jì)196個(gè)包囊，包囊直徑為(3.25±1.44) mm。感染6、9個(gè)月小鼠腹腔內(nèi)包囊囊壁增厚增白，包囊直徑增大至(7.20±2.53) mm、(9.00±2.66) mm，但包囊總數(shù)減少至86個(gè)。感染細(xì)粒棘球絳蟲12個(gè)月的10只小鼠體內(nèi)的24個(gè)包囊直徑增大至(14.21±3.14) mm，見表1。

刺破包囊囊壁，并充分漂洗囊壁，在光學(xué)顯微鏡在觀察發(fā)現(xiàn)，感染細(xì)粒棘球絳蟲微囊3～9個(gè)月小鼠體內(nèi)包囊均未見原頭蚴，而感染細(xì)粒棘球絳蟲微囊12個(gè)月的小鼠體內(nèi)包囊有原頭蚴，原頭蚴活力良好(圖2)，且10只小鼠體內(nèi)的24個(gè)包囊均可見原頭蚴，共計(jì)43 000個(gè)原頭蚴。

注：與飼養(yǎng)12個(gè)月組比較, *P<0.05。

感染時(shí)間/月小鼠數(shù)量/只包囊直徑/mm共計(jì)包囊數(shù)/含原頭蚴包囊數(shù)/個(gè)原頭蚴量/個(gè)3103.25±1.44196/006107.20±2.53130/009109.00±2.6686/00121014.21±3.1424/2443 000

a：體外培養(yǎng)細(xì)粒棘球絳蟲微囊

b：小鼠細(xì)粒棘球絳蟲感染3個(gè)月模型體內(nèi)包囊

c：小鼠細(xì)粒棘球絳蟲感染12個(gè)月模型體內(nèi)包囊

d：小鼠12個(gè)月包囊沉淀物

圖2小鼠細(xì)粒棘球絳蟲繼發(fā)感染3個(gè)月、12個(gè)月小鼠體內(nèi)包囊和囊液沉淀物

分離感染不同時(shí)期小鼠體內(nèi)包囊，經(jīng)過4%多聚甲醛固定、伊紅預(yù)染色、酒精脫水、石蠟包埋和HE染色，結(jié)果顯示，感染不同時(shí)期包囊生發(fā)層和角質(zhì)層染色均勻，但感染早期生發(fā)層著色較深，說明生發(fā)層生長較為活躍[8]。感染晚期生發(fā)層逐漸成熟，著色較淺。測(cè)量角質(zhì)層厚度發(fā)現(xiàn)感染6個(gè)月、9個(gè)月的包囊囊壁的角質(zhì)層厚度較感染3個(gè)月也表現(xiàn)出增厚，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但感染12個(gè)月包囊角質(zhì)層厚度約為(713.41±91.08) μm，較感染3個(gè)月包囊囊壁角質(zhì)層厚度[(206.89±43.93) μm]明顯增厚，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3，提示包囊囊壁角質(zhì)層的厚度與產(chǎn)生原頭蚴有關(guān)。

2.2小鼠血清抗體的變化飼養(yǎng)3個(gè)月正常組小鼠血清OD值為(0.30±0.09)，感染細(xì)粒棘球絳蟲微囊3個(gè)月小鼠血清OD值為(1.19±0.13) (P/N≥3，為陽性)，與正常組比較抗體水平明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)感染12個(gè)月小鼠血清OD值為(1.51±0.41)，與同批正常小鼠血清OD值比較也明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

a：感染3個(gè)月小鼠包囊病灶LL角質(zhì)層(laminated layer); b：感染12個(gè)月小鼠包囊病灶GL生發(fā)層(germinal layer)

圖3小鼠細(xì)粒棘球絳蟲繼發(fā)感染模型包囊病灶的組織學(xué)觀察(100×)

羊囊液抗原檢測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲微囊感染小鼠血清，血清中囊液抗原的抗體水平隨時(shí)間變化呈遞增的趨勢(shì)，表現(xiàn)出較強(qiáng)特異性，但感染3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月、12個(gè)月小鼠血清OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明感染小鼠產(chǎn)生的抗體水平與產(chǎn)生原頭蚴無直接關(guān)系。

3 討論

Hui等[9]研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)包囊時(shí)間約為12個(gè)月，可見原頭蚴，但是原頭蚴數(shù)量較少，且需要耗費(fèi)大量的人力物力[10]等，所以我們用體內(nèi)方法生產(chǎn)原頭蚴。本研究表明小鼠感染3個(gè)月到感染12個(gè)月體內(nèi)包囊直徑從(3.25±1.44) mm增大至(14.21±3.14) mm，包囊生長呈時(shí)間依賴性增長，但是比較感染3個(gè)月小鼠體內(nèi)直徑同樣為10 mm包囊和感染12個(gè)月直徑為10 mm包囊，刺破后發(fā)現(xiàn)感染3個(gè)月包囊囊液中無原頭蚴，而感染12個(gè)月小鼠體內(nèi)包囊可發(fā)育出原頭蚴，表明包囊是否發(fā)育出原頭蚴與包囊直徑大小無直接關(guān)系。同時(shí)發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)包囊總數(shù)隨著感染時(shí)間延長，包囊總數(shù)由感染3個(gè)月的196個(gè)減少到感染12個(gè)月的24個(gè)，說明包囊在小鼠體內(nèi)生長發(fā)育呈明顯競(jìng)爭(zhēng)性，不可育包囊可能被機(jī)體侵蝕或自然死亡，可育包囊隨時(shí)間延長而發(fā)育原頭蚴。

注：與飼養(yǎng)3個(gè)月組比較,*P<0.05; 與飼養(yǎng)12個(gè)月組比較,△P<0.05。

圖4囊液抗原ELISA檢測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲小鼠模型血清抗體

ELISA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)感染3個(gè)月小鼠血清OD值為(1.19±0.13)，感染12個(gè)月小鼠血清OD值為(1.51±0.41)，呈陽性反應(yīng)。感染12個(gè)月小鼠血清OD值與感染3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月的小鼠血清OD值相比呈遞增趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明ELISA方法檢測(cè)感染小鼠血清(1∶100稀釋)抗體水平，可用來檢測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲感染是否成功，不能作為小鼠體內(nèi)包囊的是否發(fā)育出原頭蚴的指標(biāo)。

感染細(xì)粒棘球絳蟲微囊小鼠體內(nèi)包囊病理結(jié)果顯示，感染12個(gè)月模型小鼠，包囊囊壁明顯增厚、增白，包囊囊壁病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)囊壁角質(zhì)層增厚至(713.41±91.08) μm，與感染3個(gè)月小鼠體內(nèi)包囊囊壁角質(zhì)層厚度相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。很多研究也表明多房棘球絳蟲感染小鼠后3個(gè)月左右可在病灶內(nèi)發(fā)現(xiàn)原頭蚴[11]，但在感染1～9個(gè)月細(xì)粒棘球絳蟲小鼠體內(nèi)包囊未見原頭蚴[6]，說明包囊囊壁角質(zhì)層厚度可能是包囊是否發(fā)育為可育囊重要指標(biāo)。

前期研究發(fā)現(xiàn)感染細(xì)粒棘球絳蟲微囊56 w后，在BALB/c小鼠體內(nèi)一個(gè)直徑為31 mm的包囊內(nèi)發(fā)現(xiàn)4個(gè)原頭蚴[7]。本研究在小鼠感染細(xì)粒棘球絳蟲微囊12個(gè)月(52 w)即可生產(chǎn)出43 000個(gè)原頭蚴，推測(cè)新疆株細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴與澳大利亞株細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴在BALB/c小鼠體內(nèi)存在明顯差別，而新疆株細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴在BALB/c小鼠體內(nèi)生長發(fā)育更快。有研究報(bào)道，通過腹腔注射15 000個(gè)新疆株原頭蚴感染子午砂土鼠，在357 d發(fā)現(xiàn)8只小鼠中有7只小鼠體內(nèi)包囊可發(fā)育出原頭蚴[12]，而在本研究中通過腹腔注射35個(gè)細(xì)粒棘球絳蟲微囊，感染12個(gè)月的10只BALB/c小鼠體內(nèi)均可見原頭蚴。推測(cè)可能新疆株細(xì)粒棘球絳蟲微囊在BALB/c小鼠體內(nèi)生長更為穩(wěn)定，并發(fā)育良好。

本研究結(jié)合細(xì)粒棘球絳蟲體外培養(yǎng)和小鼠體內(nèi)感染完成原頭蚴→原頭蚴的實(shí)驗(yàn)室循環(huán)，并用感染細(xì)粒棘球絳蟲小鼠生產(chǎn)出原頭蚴，不僅為后期細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴取材提供一個(gè)時(shí)間借鑒，還可維持穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)室研究用原頭蚴，最終為后期研究細(xì)粒棘球絳蟲的克隆奠定基礎(chǔ)。