武 洋， 伊力哈木江·克尤木， 李少華， 邵培培， 程路峰

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室， 烏魯木齊 830011)

關(guān)鍵字： 慢性心力衰竭； CD4+CD25+ Treg細(xì)胞； Th17/Treg； Kv1.3鉀離子通道； 全細(xì)胞膜片鉗

慢性心力衰竭(Chronic heart failure，CHF)是大多數(shù)心血管疾病的歸宿，表現(xiàn)為心臟不能適應(yīng)體循環(huán)的靜脈回流，性能下降，長期難以滿足機(jī)體代謝需求。最常見的病因包括心肌病、瓣膜病、心肌炎、感染、系統(tǒng)性毒素、心臟毒性藥物等[1]。近期的研究表明在美國大約有500萬的心臟衰竭患者，到2030年這種綜合征的患病率還會(huì)增加25%[2]。我國心衰患病率已達(dá)到1.3%，現(xiàn)心力衰竭患者約有800～1 000萬人，中國很可能已成為全世界心衰患者最多的國家。約50%的心衰患者在確診后5年內(nèi)死亡，約20%的心衰患者在確診后1年內(nèi)死亡[3]。當(dāng)心肌組織受到外界因素或一些內(nèi)環(huán)境紊亂導(dǎo)致機(jī)體損傷時(shí)，會(huì)通過一系列的炎癥反應(yīng)來進(jìn)行修復(fù)損傷，即普遍認(rèn)為CHF也是一種長期的慢性炎癥過程。近年來，對(duì)于各種CHF中炎癥細(xì)胞的研究引起的關(guān)注越來越多，有證據(jù)顯示，T淋巴細(xì)胞及其各類亞型的平衡發(fā)揮著極其重要的作用[4-5]。CD4+CD25+Treg細(xì)胞可通過抑制細(xì)胞因子的表達(dá)、抑制目標(biāo)T細(xì)胞的細(xì)胞代謝紊亂、調(diào)節(jié)細(xì)胞溶解、樹突狀細(xì)胞成熟的功能等多種機(jī)制引起免疫抑制[6]。

Treg細(xì)胞通過抑制機(jī)體自身免疫來維護(hù)機(jī)體耐受性，而Th17細(xì)胞則介導(dǎo)了炎癥的感應(yīng)和傳播。Th17/Treg的失衡使得機(jī)體自身免疫受損從而影響CHF的發(fā)生發(fā)展。

Kv1.3已被證實(shí)在T細(xì)胞的活化中發(fā)揮了作用[7]。本次實(shí)驗(yàn)就是運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)[8]，對(duì)CD4+CD25+Treg細(xì)胞Kv1.3通道的電流及電活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)記錄，從而進(jìn)一步分析該細(xì)胞的生理活性，為心力衰竭的免疫學(xué)機(jī)制研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 外周血 心衰組外周血選取2016年1月-2017年5月新疆某三級(jí)甲等醫(yī)院心力衰竭科及心內(nèi)科收治的慢性心力衰竭患者，選取同期體檢合格的志愿者為正常對(duì)照組。

1.1.2 主要試劑 CBA試劑盒(Becton Dickinson，美國)，免疫磁珠分選試劑盒(Miltenyi Biotec，德國)，ELISA試劑盒(鈺博，上海)等。

1.1.3 儀器 FACSAriaTMII流式細(xì)胞檢測(cè)儀(BD，美國)，倒置顯微鏡(Leica，德國)，玻璃電極拉制儀(Narishige，日本)，顯微操作三維推進(jìn)器(Burleigh，加拿大)，膜片鉗刺激器(Nihon Kohden，日本)，等。

1.1.4 溶液配制 磁珠分選Buffer PBS溶液500 mL加入2 mL 0.5 mol/L的乙二胺四乙酸，2.5 g牛血清白蛋白，調(diào)節(jié)溶液pH至7.2，用0.22 μm無菌過濾器濾過后于無菌容器。細(xì)胞內(nèi)液使用5.0 mL 3 mol/L KCl、0.1 mL 1 mol/L CaCl2、0.1 mL 1 mol/L MgCl2、0.1 mL 1 mol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸、0.1 mL 0.1 mol/L乙二醇四乙酸置于100 mL燒杯中，使用約90 mL去離子超純水溶解上述試劑，用KOH調(diào)節(jié)pH至7.20，最后使用去離子定容于100 mL容量瓶，用0.22 μm無菌過濾器濾過后置于無菌容器。細(xì)胞外液 3.0 mL 5 mol/L NaCl、0.4 mL 1 mol/L KCl、0.1 mL1 mol/L CaCl2、0.1 mL 1 mol/L HEPES置于100 mL燒杯中，使用約90 mL去離子超純水溶解上述試劑，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.35，最后使用去離子定容于100 mL容量瓶,用0.22 μm無菌過濾器濾過后置于無菌容器。

1.2方法

1.2.1 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：自愿知情參加，符合診斷標(biāo)準(zhǔn)心功能NY-HA分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)，左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)≤ 40%，(BNP)≥ 3 000。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除急慢性炎癥疾病，自身免疫性疾病，存在嚴(yán)重的肝功能、腎功能不全的患者，腫瘤病人及妊娠期婦女等

1.2.2 微量樣多重蛋白流式檢測(cè)免疫因子 制備細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品，取凍干標(biāo)準(zhǔn)品微球， 將標(biāo)準(zhǔn)品微球轉(zhuǎn)移到一支15 mL錐形離心管中標(biāo)記為最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品，2 mL實(shí)驗(yàn)稀釋液緩慢稀釋重懸該標(biāo)準(zhǔn)品。重懸后放置于室溫穩(wěn)定20 min。取出12根12 mm×75 mm流式上樣管，分別標(biāo)記梯度稀釋的倍數(shù)為：1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024、1∶2 048、空白陰性對(duì)照，每管各加入300 μL實(shí)驗(yàn)稀釋液，依次取300 μL高濃度管中的液體到低濃度管中，吹打混合?；旌霞?xì)胞因子捕獲微球，200 g離心5 min，棄上清加血清增強(qiáng)緩沖液避光孵育30 min。矯正調(diào)整流式儀器，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 取100 μL抗凝全外周血，Th17細(xì)胞染色加入表面標(biāo)記抗體5 μL CD3、20 μL CD4、20 μL CD183、5 μL CD196，Treg細(xì)胞染色加入表面標(biāo)記抗體20 μL CD4、20 μL CD25、5 μL CD127，避光孵育30 min，取出后裂解紅細(xì)胞，洗滌后，加入緩沖液吹打均勻后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)免疫因子 室溫下平衡試劑20 min。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔，每孔加入50 μL梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)置樣本孔，每孔加入10 μL血漿及40 μL樣品稀釋液。除空白孔以外其余標(biāo)準(zhǔn)品孔與樣本孔中加入辣根過氧化物酶(HRP) 標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，封板后37℃孵育60 min。孵育后洗板，加入底物A、B各50 μL，37℃孵育15 min，加入終止液15 min內(nèi)于450 nm波長下檢測(cè)IL-10、TGF-β的吸光度值。

1.2.5 全細(xì)胞膜片鉗 Psora-4組、CHF組、正常對(duì)照組、CHF+EPL組采用全細(xì)胞膜片鉗方法，電壓鉗模式下記錄Psora-4組、CHF組、正常對(duì)照組與CHF+EPL組CD4+CD25+Treg細(xì)胞Kv1.3鉀離子通道的電流變化。將細(xì)胞從培養(yǎng)放置于膜片鉗浴槽，沉降細(xì)胞大約10 min，待細(xì)胞貼壁牢固后，開啟氣泵與灌流裝置，緩慢輕柔的使用細(xì)胞外液灌流細(xì)胞，使懸浮在上層的細(xì)胞隨細(xì)胞外液流出僅剩底層貼壁的細(xì)胞。玻璃微電極尖端內(nèi)注入約1/3的細(xì)胞內(nèi)液，將玻璃微電極置入儀器中，尖端與選中的目標(biāo)細(xì)胞實(shí)現(xiàn)完全按壓式接觸后鉗制細(xì)胞，其二者封接電阻數(shù)值單位為GΩ時(shí)，繼續(xù)向細(xì)胞施加負(fù)壓以吸破細(xì)胞膜形成一個(gè)全細(xì)胞膜片鉗記錄，對(duì)其對(duì)接電位、電容、電流進(jìn)行適當(dāng)?shù)难a(bǔ)償，待形成最終穩(wěn)定電流線時(shí)，串聯(lián)電阻補(bǔ)償80%。后進(jìn)行Patch Master刺激方案，刺激方案為：在-70 mV的膜片鉗鉗制電壓下，給予CD4+CD25+Treg淋巴細(xì)胞Kv1.3鉀離子通道-80到+40 mV的斜率刺激，磁場(chǎng)時(shí)長為400 ms，即得到一條自下而上的電流-電壓(I-V)曲線，數(shù)據(jù)記錄在電腦以備后續(xù)分析。

2 結(jié)果

2.12組微量樣多重蛋白流式免疫因子熒光強(qiáng)度(MFI)的比較CHF組各炎癥因子熒光強(qiáng)度明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.22組Th17與Treg細(xì)胞的比較檢測(cè)兩組抗凝外周血全血可知，CHF組Th17細(xì)胞[(19.50±1.81)%]明顯多于正常對(duì)照組[(13.94±1.55)%]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；CHF組Treg細(xì)胞[(6.95±1.65)%]明顯少于正常對(duì)照組[(14.85±1.92)%],差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見表2。

表1 正常對(duì)照組與CHF組免疫因子熒光強(qiáng)度(MFI) 比較

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

表2CHF組與正常對(duì)照組Th17與Treg細(xì)胞的比較

組別nTh17/%Treg/%Th17/Treg正常對(duì)照組813.94±1.5514.85±1.920.95±0.12CHF組1419.50±1.81*6.95±1.65*2.97±0.86*

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.001。

2.32組ELISA法測(cè)定IL-10、TGF-β含量比較ELISA法檢測(cè)外周血IL-10及TGF-β水平，結(jié)果顯示CHF組IL-10的含量明顯高于正常對(duì)照組[(36.84±5.42) pg/mL vs (22.21±3.26) pg/mL，n=60](P<0.01)；CHF組TGF-β的含量明顯高于正常對(duì)照組[(5131.25±829.65) pg/mL vs (1775.83±541.16) pg/mLl，n=60] (P<0.01)，見表3。

表3CHF組與正常對(duì)照組ELISA法測(cè)免疫因子含量比較

組別nIL-10/(pg/mL) TGF-β/(ng/mL) CHF組4036.84±5.145.13±0.83正常對(duì)照組2022.21±3.26*1.77±0.54*

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.01。

2.42組CD4+CD25+Treg細(xì)胞Kv1.3鉀離子通道峰值電流密度比較

2.4.1 正常對(duì)照組與Psora-4組CD4+CD25+Treg細(xì)胞Kv1.3鉀離子通道電流密度峰值比較 使用Kv1.3阻斷劑Psora-4灌流CD4+CD25+Treg細(xì)胞15 min，Kv1.3鉀離子通道電流峰值電流密度為(35.6±3.51) pA/pF，峰值電流密度較正常對(duì)照組(106.11±10.47) pA/pF明顯下降,見圖1。

(左圖為斜率刺激下的原始電流圖，灰線為標(biāo)準(zhǔn)誤；右圖為+40 mV下的電流密度柱形圖)

2.4.2 CHF組與正常對(duì)照組CD4+CD25+Treg細(xì)胞Kv1.3鉀離子通道峰值電流密度比較 在-80 mV～ 40 mV的梯度刺激方案下對(duì)兩組外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗測(cè)定其電流，可見一條電壓依賴時(shí)間依賴的逐漸增大的曲線。CHF組人外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞Kv1.3鉀離子通道電流峰值電流密度為(259.57±19.07) pA/pF，細(xì)胞個(gè)數(shù)n=22，正常對(duì)照組為(106.11±10.47) pA/pF，細(xì)胞個(gè)數(shù)n=20,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖2。

圖2 CHF組與正常對(duì)照組外周血CD4+CD25+ Treg細(xì)胞Kv1.3鉀離子通道I-V曲線

(左圖為斜率刺激下的原始電流圖，灰線為標(biāo)準(zhǔn)誤；右圖為+40 mV 下的電流密度柱形圖)

2.4.3 CHF組與CHF+EPL組CD4+CD25+Treg細(xì)胞Kv1.3鉀離子通道峰值電流密度比較 使用醛固酮受體拮抗劑依普利酮灌流CD4+CD25+Treg細(xì)胞15 min，Kv1.3鉀離子通道電流峰值電流密度為(41.21±3.61) pA/pF,較CHF組(259.57±19.07) pA/pF明顯下降,見圖3。

圖3 CHF組與CHF+EPL組外周血CD4+CD25+ Treg細(xì)胞Kv1.3鉀離子通道I-V曲線

(左圖為斜率刺激下的原始電流圖，灰線為標(biāo)準(zhǔn)誤；右圖為+40 mV 下的電流密度柱形圖)

3 討論

心力衰竭是一種高度復(fù)雜的疾病，可由急性損傷(如心肌梗塞或慢性過程如腎功能障礙、高血壓)或主動(dòng)脈狹窄引起。發(fā)病初期，心臟可以適應(yīng)與慢性疾病相關(guān)的體積或壓力超負(fù)荷，但隨著病程的加重，肥大的心臟轉(zhuǎn)化為心力衰竭。慢性炎癥、異常鈣處理、心肌細(xì)胞凋亡和心肌纖維化、神經(jīng)激素激活等都會(huì)影響到心力衰竭的病程進(jìn)展[9]。在許多臨床研究中，慢性心力衰竭進(jìn)展過程中都觀察到有慢性炎癥的跡象[10]，促炎因子如白介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)等的高表達(dá)尤為突出。因此，更好的了解炎癥的作用和自身免疫在心力衰竭的病理生理學(xué)治療新靶點(diǎn)上的作用是至關(guān)重要的[11-13]。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，慢性心衰組的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF、IFN-γ熒光強(qiáng)度均高于正常對(duì)照組。IL-6主要是一種促炎介質(zhì)，慢性心衰組中IL-6的含量遠(yuǎn)高于正常組，說明心衰患者體內(nèi)存在著嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。IL-10被認(rèn)為是一種抗炎的細(xì)胞因子，具有保護(hù)作用，它能在調(diào)節(jié)炎癥中起到關(guān)鍵作用，雖然慢性心衰組IL-10的熒光強(qiáng)度也大于正常對(duì)照組，但不足以對(duì)抗其他炎性因子的致炎作用，故慢性心力衰竭組整體上還是呈現(xiàn)出炎癥狀態(tài)。

CD4+CD25+Treg細(xì)胞在炎癥和免疫調(diào)節(jié)中的作用受到越來越多的關(guān)注，鑒于Treg細(xì)胞在誘導(dǎo)和維持免疫穩(wěn)態(tài)和耐受方面都起到重要，對(duì)其在慢性心力衰竭中的影響研究也顯得十分必要。Tang等[5]研究表明，Treg細(xì)胞可能預(yù)防治療心血管疾病，CD4+CD25+Treg細(xì)胞對(duì)自體和外來抗原(包括同種異體)的免疫平衡和耐受性至關(guān)重要[14]。本實(shí)驗(yàn)采用免疫磁珠分離CD4+CD25+Treg細(xì)胞，既可以得到純度較高的CD4+CD25+Treg細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的損傷程度也較小，更有利于進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，吹打力度輕柔，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)時(shí)間，洗滌時(shí)在洗滌溶液內(nèi)加入一定量的胎牛血清營養(yǎng)細(xì)胞，都能在一定程度上改善細(xì)胞狀態(tài)。

CD196是Th17細(xì)胞重要表面標(biāo)志分子，表達(dá)于未成熟的DC細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞以及Th17型記憶性T細(xì)胞，又稱CCR6；CD196是一種細(xì)胞因子受體，在記憶性T細(xì)胞募集到黏膜炎癥組織的過程中發(fā)揮作用；人Th17細(xì)胞亞群能夠特異性分泌IL-17并表達(dá)CD196，而其他輔助性T細(xì)胞亞群(Th1&Th2)不表達(dá)CD196，因此CD196能夠作為Th17的特異性鑒定標(biāo)記物。CD127是Treg細(xì)胞的重要表面標(biāo)志分子，被發(fā)現(xiàn)與Treg細(xì)胞的特異性標(biāo)記物FoxP3mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)，可以幫助識(shí)別CD4+CD25+Treg細(xì)胞，且更便于操作，易得結(jié)果[15]。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)面CHF組Th17的含量比正常對(duì)照組中的高，而Treg細(xì)胞的比例CHF組要低于正常對(duì)照組，CHF組的Th17/Treg比例大于正常對(duì)照組，提示慢性心力衰竭中存在著炎癥反應(yīng)，且細(xì)胞比例偏向于促炎。考慮是否可以通過改變Th17/Treg的比例來糾正炎癥反應(yīng)從而治療慢性心力衰竭。

Kv1.3是一種電壓門控的鉀離子通道(Kv)，它是對(duì)膜去極化的反應(yīng)[16]，功能性Kv1.3是由孔形成的亞單位和膜去極化的同質(zhì)四聚體組成的[17]，在每個(gè)亞基的第四跨膜區(qū)域帶正電荷的精氨酸殘基，在T細(xì)胞活化中發(fā)揮作用[18-20]。由淋巴細(xì)胞表達(dá)的鉀離子通道對(duì)膜電位和鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)控起著至關(guān)重要的作用，影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致這些細(xì)胞在免疫反應(yīng)后激活[21]。也有研究顯示，Kv1.3鉀離子通道調(diào)控Treg細(xì)胞的增殖、成熟和分化的能力，可能只局限于免疫系統(tǒng)[22-23]。因此，鉀離子通道Kv1.3的激活調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞功能，可能在心力衰竭的病理生理學(xué)中發(fā)揮作用。從本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出，給予正常對(duì)照組CD4+CD25+Treg細(xì)胞Kv1.3通道阻滯劑Psora-4后，發(fā)現(xiàn)電流密度明顯降低，說明該電流密度曲線確實(shí)為Kv1.3通道的電流密度曲線。CHF組CD4+CD25+Treg細(xì)胞Kv1.3鉀離子通道的電流密度比正常對(duì)照組高出一倍多，可以推測(cè)心衰組Treg的細(xì)胞活性高于正常對(duì)照組，Treg細(xì)胞參與了慢性心力衰竭的發(fā)生與發(fā)展。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，給予依普利酮后，CHF組CD4+CD25+Treg細(xì)胞Kv1.3鉀離子通道的電流密度也有所下降，說明依普利酮很可能通過抑制Treg的細(xì)胞上的Kv1.3鉀離子通道來調(diào)控Treg細(xì)胞的活化。