畢 興， 陳海霞， 牛 越， 楊 峰， 陳 鵬

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院1泌尿科, 2病理科， 烏魯木齊 830011)

腎透明細(xì)胞癌大約占全身惡性腫瘤的2%，占全部腎臟惡性腫瘤的83%[1]，全球每年有超過10 000人死于該疾病。近年來我國腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病率和死亡率都呈現(xiàn)明顯上升趨勢[2]。與腎透明細(xì)胞癌發(fā)生相關(guān)的基因研究正在逐步成為研究熱點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺素受體基因突變與腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

甲狀腺激素受體(thyroid receptors，TRs)廣泛分布于全身所有器官和組織。它除了在機(jī)體生長、組織分化和物質(zhì)代謝中扮演重要角色，現(xiàn)在越來越多的證據(jù)表明，它能夠抑制細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)出抑制腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用[3-4]。缺少甲狀腺激素受體，或者是甲狀腺激素受體基因的沉默，在人類的癌癥或者動物實(shí)驗?zāi)Ｐ椭惺且粋€常見的現(xiàn)象。關(guān)于腎透明細(xì)胞癌中TRβ1基因的研究較多，而對于TRβ1蛋白的研究較少。本研究通過免疫組化方法檢測腎透明細(xì)胞癌和癌旁組織中TRβ1蛋白的表達(dá)情況，旨在探討其在兩種組織中的表達(dá)差異及其臨床意義。

1 對象和方法

1.1研究對象應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字法選取新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2011-2017年行手術(shù)治療的腎透明細(xì)胞癌患者40例。所有病例均根據(jù)2004版WHO腎癌組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)確診為腎透明細(xì)胞癌，并且術(shù)前未行包括放療、化療、靶向藥物治療在內(nèi)的任何抗腫瘤治療。組織(腎透明細(xì)胞癌組織和癌旁組織)標(biāo)本均經(jīng)兩名病理醫(yī)師一致判定?；颊吣挲g33～80歲，平均58.8歲；Fuhrman組織學(xué)分級:1級9例，2級21例，3級7例，4級3例；分期(根據(jù)2010年American Joint Committee on Cancer腎癌分期組合)：Ⅰ期21例，Ⅱ期3例，Ⅲ期13例，Ⅳ期3例。隨訪9～78個月，術(shù)后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移13例，未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移27例。

1.2實(shí)驗方法應(yīng)用免疫組化聚合物法(PV二步法)檢測腎透明細(xì)胞癌和癌旁組織中TRβ1蛋白的表達(dá)情況。選擇鼠抗人單克隆抗體TRβ1(J51)：sc-737( Santa Cruz Biotechnology Inc)高壓修復(fù)，余步驟按常規(guī)PV二步法進(jìn)行。

1.3結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)TRβ1蛋白在腎透明細(xì)胞癌(旁)組織中的陽性染色呈顆粒狀或團(tuán)塊狀，顯示為淡黃色、棕黃色和棕褐色。至少觀察5～10個高倍鏡視野，取其平均值。對陽性細(xì)胞進(jìn)行評分：(1)染色強(qiáng)度：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)陽性細(xì)胞所占百分比：陰性為0分，陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，≥75%為4分。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞所占百分比2項得分相乘，結(jié)果<2分為陰性，≥2分為陽性(≥2分且<3分為“+”，≥3分并且<4分為“++”，≥4分為“+++”)

1.4統(tǒng)計學(xué)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，不同分期、不同組織學(xué)分級、是否壞死、是否轉(zhuǎn)移與TRβ1蛋白表達(dá)情況的相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析；TRβ1蛋白表達(dá)與不同病理組織(腎透明細(xì)胞癌組織和癌旁組織)表達(dá)差異分析采用四格表卡方檢驗,檢驗水準(zhǔn)均設(shè)定為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1免疫組化染色本組中，腎透明細(xì)胞癌組織TRβ1的染色均為陰性(圖1)，陽性表達(dá)率為0(0/40)；癌旁正常腎組織TRβ1陽性表達(dá)率為50%(20/40)，2種組織TRβ1陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=26.667，P<0.001)。并且TRβ1只在癌旁組織的細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)為弱陽性(+)、陽性(++)(圖2)，細(xì)胞核無陽性表達(dá)。

圖2 TRβ1蛋白在腎透明細(xì)胞癌旁組織中陽性表達(dá)(x100)

2.2腎透明細(xì)胞癌旁組織TRβ1蛋白表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系TRβ1蛋白在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期腎透明細(xì)胞癌旁組織中陽性表達(dá)率分別為57.14%(12/21)、66.67%(2/3)、38.46%(5/13)、33.33%(1/3)，TRβ1蛋白在腎透明細(xì)胞癌旁組織中的表達(dá)與分期無明顯相關(guān)性(r=-0.215，P=0.183)。TRβ1蛋白在腎透明細(xì)胞癌Fuhrman分級1、2、3、4級癌旁組織中陽性表達(dá)率分別為66.67%(6/9)、47.62%(10/21)、42.86%(3/7)、33.33%(1/3)，TRβ1蛋白在腎透明細(xì)胞癌旁組織中的表達(dá)與Fuhrman分級呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.425，P=0.006)。有壞死的腎透明細(xì)胞癌癌旁組織中TRβ1蛋白陽性表達(dá)率28.57%(2/7)，無壞死的腎透明細(xì)胞癌癌旁組織中TRβ1蛋白陽性表達(dá)率54.55%(18/33)，腎透明細(xì)胞癌癌旁組織中TRβ1蛋白表達(dá)與癌組織中是否有壞死無相關(guān)性(r=-0.035，P=0.832)。術(shù)后發(fā)生轉(zhuǎn)移的腎透明細(xì)胞癌癌旁組織中TRβ1蛋白陽性表達(dá)率46.15%(6/13)，術(shù)后沒有轉(zhuǎn)移的腎透明細(xì)胞癌癌旁組織中TRβ1蛋白陽性表達(dá)率51.85%(14/27)，腎透明細(xì)胞癌癌旁組織中TRβ1蛋白表達(dá)與術(shù)后是否發(fā)生轉(zhuǎn)移有相關(guān)性(r=-0.386，P=0.014),結(jié)果見表1。

表1 腎透明細(xì)胞癌旁組織TRβ1蛋白表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系/例

3 討論

隨著腎透明細(xì)胞癌發(fā)病率的不斷上升，與其發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的分子生物學(xué)機(jī)制正在受到關(guān)注。甲狀腺素受體(TRs)屬于核受體超家族，三碘甲狀腺素(T3)正是通過TRs的介導(dǎo)來發(fā)揮生物學(xué)作用[5-8]。甲狀腺素受體(TRs)是有兩條基因TRα和TRβ編碼，TRα和TRβ基因分別定位于17q21和3p24。TRα基因編碼的受體包括TRα1、TRα2和截短型蛋白△TRα1、△TRα2；TRβ基因編碼的受體包括TRβ1、TRβ2 、TRβ3和截短型蛋白△TRβ。以上產(chǎn)物中只有TRα1、TRβ1、TRβ2能和T3特異性的結(jié)合，各自的親和力不同，作用也不同[9-10]。

近年的研究發(fā)現(xiàn)TRβ1在多種癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，其基因突變與胃癌、乳腺癌、甲狀腺癌、腎透明細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)[11-12]。TRβ1能夠抑制腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。它可以抑制腫瘤的血管生成，抑制細(xì)胞增殖[13]，增加腫瘤細(xì)胞的凋亡，阻礙腫瘤細(xì)胞對生長因子的反應(yīng)，降低多種能夠促進(jìn)腫瘤生長的蛋白酶活性和基因表達(dá)。其基因突變將造成腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

也有研究表明，TRβ1作用機(jī)制與其它信號通路相互交叉。如TRβ1可以和腫瘤抑制因子P53蛋白相結(jié)合并加強(qiáng)P53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性。相反，P53能夠降低TRβ1與DNA結(jié)合的能力和激活轉(zhuǎn)錄的能力。另外，腎透明細(xì)胞癌中miRNAs也反饋調(diào)節(jié)TRβ1，可能成為致癌因子[14-15]。

本研究的結(jié)果顯示，應(yīng)用免疫組化PV二步法在腎透明細(xì)胞癌組織中未發(fā)現(xiàn)TRβ1蛋白表達(dá)，而在與其對照的癌旁正常腎組織中有50%呈現(xiàn)陽性表達(dá)，兩種不同病理組織差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。這一結(jié)果與Monika等[12]的研究結(jié)果基本一致，即TRβ1蛋白在腎透明細(xì)胞癌組織中呈明顯低表達(dá)。因此應(yīng)用免疫組化PV二步法檢測TRβ1蛋白可能有助于腎透明細(xì)胞癌的病理鑒別診斷。Monika等[12]的研究還顯示，腎透明細(xì)胞癌組織中TRβ1在mRNA和蛋白水平表達(dá)并不一致，70%的腎透明細(xì)胞癌組織中TRβ1 mRNA呈現(xiàn)低表達(dá)，而另外30% TRβ1 mRNA呈現(xiàn)高表達(dá)。即使在TRβ1 mRNA高表達(dá)情況下，應(yīng)用Western blots 法也僅僅勉強(qiáng)可測出TRβ1蛋白。這與本研究在腎透明細(xì)胞癌組織中未發(fā)現(xiàn)TRβ1蛋白陽性表達(dá)略有不同。筆者認(rèn)為，造成這種結(jié)果的原因主要有兩方面：(1)TRβ1蛋白本身濃度不高，且不穩(wěn)定；(2)方法不同，造成檢測的敏感性存在差異。另外，腎透明細(xì)胞癌組織中TRβ1蛋白不表達(dá)或者低表達(dá)這一結(jié)果支持TRβ1蛋白抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的生物學(xué)作用機(jī)理。TRβ1蛋白的缺失與腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)腎透明細(xì)胞癌旁組織中TRβ1蛋白表達(dá)情況與病理分期、腫瘤是否有壞死無相關(guān)性，與腎透明細(xì)胞癌組織Furman分級(r=0.425，P=0.006)呈正相關(guān)，與術(shù)后是否發(fā)生轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)(r=-0.386，P=0.014)。上述結(jié)果提示腎透明細(xì)胞癌旁組織中TRβ1蛋白表達(dá)情況可能與預(yù)后相關(guān)。對于上述結(jié)果的生物學(xué)意義尚不明確，筆者認(rèn)為腎透明細(xì)胞癌旁組織中TRβ1蛋白陽性率(程度)隨著腎透明細(xì)胞癌組織Furman分級的升高而升高，可能與腫瘤周圍組織對于不同惡性程度的腫瘤產(chǎn)生程度不同的TRβ1蛋白應(yīng)激性升高有關(guān)。另一方面，腎透明細(xì)胞癌旁組織中TRβ1蛋白陽性率(程度)越高，術(shù)后發(fā)生轉(zhuǎn)移的幾率越低，這也符合TRβ1蛋白的抑癌作用機(jī)理。

綜上所述，本研究應(yīng)用免疫組化PV二步法發(fā)現(xiàn)腎透明細(xì)胞癌組織中TRβ1蛋白無陽性表達(dá)，癌旁組織中有50%呈現(xiàn)TRβ1蛋白陽性表達(dá)，兩組存在明顯差異。這一結(jié)果提示應(yīng)用免疫組化PV二步法檢測TRβ1蛋白可能有助于腎透明細(xì)胞癌的病理鑒別診斷。同時也支持TRβ1蛋白抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的生物學(xué)作用機(jī)理。腎透明細(xì)胞癌旁組織中TRβ1蛋白表達(dá)情況與腎透明細(xì)胞癌組織Furman分級呈正相關(guān)，與術(shù)后是否發(fā)生轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。上述結(jié)果提示腎透明細(xì)胞癌旁組織中TRβ1蛋白表達(dá)情況可能與預(yù)后相關(guān)。而上述結(jié)果的生物學(xué)意義有待更深層次的研究。另外，由于本研究樣本量少，上述實(shí)驗結(jié)果仍需大量研究來證實(shí)。