董靜,姚妙愛
(江蘇財(cái)經(jīng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江蘇 淮安 223003)
酸甘藍(lán)作為一種傳統(tǒng)的發(fā)酵蔬菜腌制品,其酸香味鮮,口感脆爽,不僅可以直接食用,還可用于制作美味的漬菜粉、酸菜湯。具有開胃除膩,增進(jìn)食欲,幫助消化的功效,能夠促進(jìn)人體對(duì)鐵等礦質(zhì)元素的吸收,并且其發(fā)酵和生產(chǎn)過(guò)程簡(jiǎn)單,人們對(duì)此都津津樂道[1,2]。酸甘藍(lán)主要是通過(guò)乳酸發(fā)酵而成,不僅保留了VC、氨基酸、有機(jī)酸以及膳食纖維等原料原有的營(yíng)養(yǎng)成分,還含有乳酸菌等功能性微生物[3],隨著人們進(jìn)一步揭示了乳酸菌對(duì)人體健康有益作用的機(jī)理,酸菜生產(chǎn)與加工引起了國(guó)內(nèi)外的高度重視。
隨著微生物技術(shù)的發(fā)展,酸甘藍(lán)工藝有了不同程度的改變,對(duì)發(fā)酵劑、食鹽濃度進(jìn)行了大量的研究,Elena Peas等研究發(fā)現(xiàn)酸甘藍(lán)質(zhì)量好和生物胺含量最低的最佳發(fā)酵條件是腸膜明串珠菌和0.5%食鹽濃度[4]。韓國(guó)玲等提出發(fā)酵劑5%乳酸菌純培養(yǎng)物[5],發(fā)酵溫度20~25℃,發(fā)酵時(shí)間20天條件下發(fā)酵的酸白菜在感官指標(biāo)上有明顯改善;祝戰(zhàn)斌等認(rèn)為采用鹵汁食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.25%[6],白糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%,發(fā)酵溫度為22℃,發(fā)酵接種量為1%的自然發(fā)酵結(jié)合人工接種發(fā)酵甘藍(lán)泡菜具備自然發(fā)酵風(fēng)味好、人工接種時(shí)間快的優(yōu)點(diǎn)。
由于酸甘藍(lán)發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生亞硝酸鹽,令許多消費(fèi)者望而生畏,我國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,醬腌菜中亞硝酸鹽含量不得超過(guò)20mg/kg,降低酸甘藍(lán)中亞硝酸鹽的含量是其工業(yè)化生產(chǎn)必須要解決的問(wèn)題。本研究以酸甘藍(lán)的感官指標(biāo)、營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、安全指標(biāo)、生產(chǎn)周期等綜合評(píng)價(jià)為指標(biāo)值,研究了適宜于工業(yè)化實(shí)施的食鹽添加量、接種量、發(fā)酵溫度等發(fā)酵條件對(duì)酸甘藍(lán)綜合品質(zhì)的影響并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化,這將對(duì)酸甘藍(lán)工業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?;a(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。
1.1.1 原料
結(jié)球甘藍(lán)(包菜):購(gòu)于淮安農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);
植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum):遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供;
泡菜鹽:江蘇省鹽寶鹽業(yè)有限公司。
1.1.2 試劑
碳酸氫鈉、抗壞血酸、乙酸鋅、冰醋酸、亞鐵氰化鉀、硼酸鈉、鹽酸、對(duì)氨基苯磺酸、亞硝酸鈉、鹽酸萘乙二胺、硝酸鈉、氨水、草酸、2,6-二氯靛酚、牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、乙酸鈉、檸檬酸二胺、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫80、磷酸氫二鉀、瓊脂(均為國(guó)藥分析純)。
MRS液體試管培養(yǎng)基:蛋白胨1.0g,葡萄糖5.0g,牛肉膏1.0g,酵母膏0.5g,乙酸鈉0.5g,硫酸錳0.025g,檸檬酸二胺0.2g,硫酸鎂0.02g,吐溫80 0.1g,磷酸氫二鉀0.2g,加蒸餾水至100mL,pH 6.2~6.4,121℃,15~20min滅菌[7]。
MRS固體試管培養(yǎng)基:在MRS液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加瓊脂2g。
DZQ400-2D真空包裝機(jī) 昆山康佳包裝機(jī)械有限公司;SW-CJ-2F超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;LDZX-50FA滅菌鍋、LHS-150SC電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;PHS-3C酸度計(jì) 上海世義精密儀器有限公司;FA1004電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;S22PC可見分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司;HH-D4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠;組織搗碎機(jī):HR2095飛利浦?jǐn)嚢铏C(jī) 飛利浦(中國(guó))投資有限公司;50L雙層內(nèi)蓋塑料桶 山東慶云普利塑料制品銷售中心。
1.3.1 酸甘藍(lán)加工工藝
1.3.1.1 酸甘藍(lán)加工工藝流程
1.3.1.2 發(fā)酵劑的制備
固體試管菌種活化:將本實(shí)驗(yàn)室篩選后保存在冰箱中的固體菌種穿刺接種到固體MRS試管培養(yǎng)基中,在37℃下培養(yǎng)24h,得活化菌種。
液體試管菌種制備:將培養(yǎng)好的固體試管中的菌種接種到盛有5mL液體MRS培養(yǎng)基的20mm×200mm試管中,混勻后放入恒溫培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)24h。
液體培養(yǎng)瓶菌種制備:將培養(yǎng)好的液體試管中的菌種按2%(V/V)接種到盛有1L液體MRS培養(yǎng)基的1L培養(yǎng)瓶中,混勻后放入恒溫培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)24h。
種子罐菌種制備:甘藍(lán)經(jīng)整理、清洗,縱向切開,裝滿5L泡菜壇,按2%接入培養(yǎng)好的液體培養(yǎng)瓶中菌種,加入1%(W/V罐)食鹽水溶液灌滿,于30℃培養(yǎng),發(fā)酵期間保持菜在發(fā)酵水以下,直至發(fā)酵水pH達(dá)到3.5。
1.3.1.3 加工操作要點(diǎn)
甘藍(lán)挑選、修整、清洗:挑選新鮮、成熟、無(wú)病蟲害的甘藍(lán),除去外葉、老葉,挖掉根芯,清洗干凈。
裝罐、發(fā)酵:將清洗干凈的甘藍(lán)裝滿50L發(fā)酵桶,1層菜1層鹽,接入種子罐菌種,菌種分3次添加,裝滿后用木板壓蓋,加入自來(lái)水將發(fā)酵桶灌滿,菜在液面以下,在發(fā)酵液表面蓋上塑料薄膜,保持厭氧發(fā)酵。
切絲:將發(fā)酵好的甘藍(lán)放入切菜機(jī)將酸甘藍(lán)切成1.5~2mm寬的細(xì)絲[8]。
包裝:將發(fā)酵好的甘藍(lán)絲去除多余的水分,以每袋300g進(jìn)行真空塑料包裝。
1.3.2 酸甘藍(lán)發(fā)酵終點(diǎn)判斷
酸甘藍(lán)pH值達(dá)到3.5以下,每袋裝入酸甘藍(lán)300g真空包裝,置于30℃下培養(yǎng)2天不脹袋。
1.3.3 酸甘藍(lán)感官品質(zhì)評(píng)定方法
由10人組成品評(píng)小組,按照評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)表,通過(guò)感官評(píng)價(jià)酸甘藍(lán)產(chǎn)品的色澤、香氣、質(zhì)地和滋味,并做好記錄,以感官綜合評(píng)分判定產(chǎn)品的感官品質(zhì)[9],色澤滿分25、香氣滿分25、滋味滿分25、質(zhì)地滿分25,具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。
表1 酸甘藍(lán)感官品質(zhì)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1Criteria for sensory evaluation of sauerkraut
1.3.4 酸甘藍(lán)綜合品質(zhì)統(tǒng)計(jì)方法
綜合品質(zhì)的統(tǒng)計(jì)分析采用模糊綜合評(píng)判法[10],以感官評(píng)分(u1)、亞硝酸鹽含量(u2)、酸度pH(u3)、維生素C含量(u4)、發(fā)酵時(shí)間(u5)作為評(píng)價(jià)因素,評(píng)價(jià)因素U={u1,u2,u3,u4,u5}建立評(píng)價(jià)因素隸屬函數(shù),以各因素在不同處理間的最大值為基準(zhǔn),即max={ui1,ui2,ui3,ui4,ui5}=uib,通過(guò)隸屬函數(shù)得出U的模糊矩陣因素值具有均一可比性。權(quán)重系數(shù)根據(jù)各因素的重要性來(lái)給定,本文的權(quán)重系數(shù)中感官品質(zhì)0.4,亞硝酸鹽含量0.2,pH 值0.1,維生素C含量0.2,發(fā)酵時(shí)間0.1,所有權(quán)數(shù)之和為1。權(quán)重系數(shù)矩陣 M=(0.4,0.2,0.1,0.2,0.1),評(píng)價(jià)結(jié)果為V=MR,根據(jù)V的大小來(lái)判斷綜合品質(zhì)的相應(yīng)優(yōu)劣。其中亞硝酸鹽含量的數(shù)值越小,對(duì)人體的危害越小,綜合品質(zhì)越高;pH值越低說(shuō)明酸甘藍(lán)酸味越濃,綜合品質(zhì)越高;發(fā)酵時(shí)間越短,生產(chǎn)效率越高,綜合品質(zhì)越高。因此,為了品質(zhì)優(yōu)劣的一致性,將亞硝酸鹽含量、pH值、發(fā)酵時(shí)間的數(shù)值顛倒,亞硝酸鹽含量、pH值、發(fā)酵時(shí)間的隸屬函數(shù)為
1.3.5 單因素試驗(yàn)
在發(fā)酵罐中按照1%(W 鹽∶V罐)食鹽、2%(V菌種∶V罐)接種,30℃發(fā)酵,直至發(fā)酵結(jié)束,評(píng)定酸甘藍(lán)的感官品質(zhì),測(cè)定酸甘藍(lán)中維生素C、亞硝酸鹽含量,測(cè)定pH值,記錄發(fā)酵時(shí)間。分別考察食鹽添加量 (0,0.5%,1%,2%,3%)、接種量(0,0.5%,1%,2%,5%,10%)、發(fā)酵溫度(10,15,20,25,30 ℃)對(duì)酸甘藍(lán)綜合品質(zhì)的影響,平行3次試驗(yàn),取平均值。
1.3.6 響應(yīng)面分析法
確定影響酸甘藍(lán)發(fā)酵的關(guān)鍵因素后,用Design Expert軟件(Vision 7.1.3,Stat-Ease.Inc.,Minneapolis,MN.USA)設(shè)計(jì)試驗(yàn),采用Box-Behnken法,以確定最優(yōu)發(fā)酵條件。本文在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以食鹽添加量、接種量、發(fā)酵溫度3個(gè)因素為自變量,以酸甘藍(lán)綜合品質(zhì)評(píng)價(jià)V值為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn),共計(jì)17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn),通過(guò)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的二次回歸擬合分析得到各因素與響應(yīng)值間的回歸方程,分析各因素與響應(yīng)值間的主效應(yīng)、因素間的交互效應(yīng)得到最佳響應(yīng)值,最終確定酸甘藍(lán)發(fā)酵的最佳發(fā)酵條件,因素水平選取見表2。
表2 響應(yīng)面因素與水平Table 2Factors and levels of response surface
1.3.7 檢測(cè)方法
維生素C含量的測(cè)定:采用GB/T 6195-1986的2,6-二氯靛酚滴定法。
亞硝酸鹽含量的測(cè)定:采用 GB 5009.33-2010的鹽酸萘乙二胺法。
pH值的測(cè)定:采用pH計(jì)法,將酸甘藍(lán)榨汁,使用精密pH計(jì)測(cè)定汁液的pH值。
在其他因素相同的條件下,加鹽量不同可以控制微生物生長(zhǎng)及它們?cè)谑称钒l(fā)酵過(guò)程中的活動(dòng)[11];適宜的食鹽濃度不僅可以抑制有害菌的生長(zhǎng),增加保質(zhì)期,具有防腐作用,還可以增加食品的獨(dú)特風(fēng)味。甘藍(lán)在腌制時(shí)分別加入不同量的食鹽,最終產(chǎn)品的感官評(píng)分、亞硝酸鹽含量、pH值、Vc含量及綜合品質(zhì)見表3。
表3 不同食鹽添加量下酸甘藍(lán)各品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定值及綜合品質(zhì)Table 3Quality indexes values and comprehensive quality of sauerkraut at different salt content
由表3可知,食鹽的添加量為0.5%時(shí),酸甘藍(lán)的感官品質(zhì)評(píng)分最高,Vc保存最好;食鹽的添加量為1%時(shí),酸甘藍(lán)的感官品質(zhì)評(píng)分較高,亞硝酸鹽含量最低,酸度最低,發(fā)酵時(shí)間最短。食鹽的添加量在1%時(shí),酸甘藍(lán)的綜合評(píng)價(jià)值為0.725,綜合品質(zhì)最好。因此,選用食鹽添加量1%作為較優(yōu)添加量。
在發(fā)酵開始時(shí)接入大量的乳酸菌,可以迅速地生長(zhǎng)繁殖,并且抑制雜菌的生長(zhǎng),促使乳酸發(fā)酵的進(jìn)行[12],適宜的接種量,可促使乳酸菌快速地繁殖,促進(jìn)酸甘藍(lán)風(fēng)味形成。甘藍(lán)在腌制時(shí)分別接入不同的接種量,最終產(chǎn)品的感官評(píng)分、亞硝酸鹽含量、pH值、Vc含量及綜合品質(zhì)見表4。
表4 不同接種量下酸甘藍(lán)各品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定值及綜合品質(zhì)Table 4Quality indexes values and comprehensive quality of sauerkraut at different inoculum size
由表4可知,當(dāng)接種量為2%,5%時(shí)產(chǎn)品感官品質(zhì)評(píng)分高,亞硝酸鹽含量低,pH較低,VC保存較好,發(fā)酵時(shí)間較短;當(dāng)接種量為10%時(shí)Vc含量最高,發(fā)酵時(shí)間最短。發(fā)酵劑接種量為5%時(shí),酸甘藍(lán)的綜合品質(zhì)評(píng)估值為0.750,綜合品質(zhì)最好,這與韓國(guó)玲以感官質(zhì)量為指標(biāo)值,確定的最佳接種量一致。因此,選擇發(fā)酵劑5%作為較優(yōu)添加量。
酸甘藍(lán)的發(fā)酵主要是以乳酸發(fā)酵為主,其中的乳酸菌屬于中溫微生物,發(fā)酵溫度影響甘藍(lán)發(fā)酵時(shí)間和產(chǎn)品的最終酸度,分別測(cè)定不同發(fā)酵溫度下酸甘藍(lán)的感官評(píng)分、亞硝酸鹽含量、pH值、Vc含量、發(fā)酵時(shí)間和綜合品質(zhì),結(jié)果見表5。
表5 不同發(fā)酵溫度下酸甘藍(lán)的各品質(zhì)指標(biāo)值及綜合品質(zhì)Table 5Quality indexes values and comprehensive quality of sauerkraut at different fermentation temperatures
由表5可知,隨著發(fā)酵溫度的升高,亞硝酸鹽含量降低,Vc保存率升高,發(fā)酵周期縮短,生產(chǎn)成本降低。在20℃下發(fā)酵,酸甘藍(lán)的感官品質(zhì)最好,酸度最低;在30℃下發(fā)酵,亞硝酸鹽含量最低,VC含量最高,發(fā)酵時(shí)間最短。當(dāng)發(fā)酵溫度為25℃時(shí),酸甘藍(lán)的綜合品質(zhì)評(píng)估值為0.835,綜合品質(zhì)最佳。賈樹彪認(rèn)為在較低溫度下發(fā)酵效果較好,對(duì)發(fā)酵過(guò)程的起動(dòng)與產(chǎn)品風(fēng)味的形成有重要的作用,但發(fā)酵溫度過(guò)低,發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng),生產(chǎn)成本高,VC保存率低。發(fā)酵溫度過(guò)高,發(fā)酵過(guò)程中極易引起雜菌的生長(zhǎng),引起酸甘藍(lán)腐爛變質(zhì)、變色、變味,導(dǎo)致發(fā)酵管理困難。在不同的溫度下發(fā)酵甘藍(lán),發(fā)酵結(jié)束時(shí),酸甘藍(lán)中亞硝酸鹽的含量均遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),食用安全。因此,選擇25℃作為較優(yōu)發(fā)酵溫度。
2.4.1 二次回歸擬合及方差分析
利用Design-Expert統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方案與結(jié)果,見表6。
表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6Experimental design and results of Box-Behnken
利用 Design Expert 7.1.3軟件對(duì)表6試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合,獲得酸甘藍(lán)的綜合品質(zhì)評(píng)價(jià)V對(duì)加鹽量、接種量以及發(fā)酵溫度的二次多項(xiàng)回歸方程:
V=0.84-8.858E-003A +4.812E-004B+0.071C+0.026AB-3.534E-003AC+0.018BC-0.072A2-0.048B2-0.15C2,對(duì)此回歸模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表7。
表7 方差分析表Table 7Results of regression analysis
由表7可知,該回歸模型P<0.0001,表明該模型極顯著,能解釋酸甘藍(lán)綜合評(píng)價(jià)值的變化。各因素的一次項(xiàng)C為極顯著,二次項(xiàng)A2和B2為顯著,C2均為極顯著,交互項(xiàng)AB和BC為顯著,且失擬項(xiàng)不顯著,表明該模型與實(shí)際情況擬合很好,可用于預(yù)測(cè)酸甘藍(lán)的綜合品質(zhì)。線性方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9881,校正系數(shù) R2=0.9729,信噪比(Adeq Precision)=22.077遠(yuǎn)大于4,表明該模型的準(zhǔn)確性、適用性較好,預(yù)測(cè)值與實(shí)際值擬合好,能夠很好用于酸甘藍(lán)綜合品質(zhì)評(píng)價(jià)的分析和預(yù)測(cè)。由F值大小可知,影響酸甘藍(lán)綜合品質(zhì)的因素主次順序?yàn)镃>A>B,即發(fā)酵溫度>食鹽添加量>接種量。
2.4.2 試驗(yàn)結(jié)果分析與優(yōu)化
利用Design Expert軟件對(duì)表6中數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合得到的二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線見圖1~圖3。
圖1 食鹽添加量與接種量交互作用的響應(yīng)面和等高線Fig.1The response surface and contour of the interaction between salt content and inculum size
由圖1可知,當(dāng)發(fā)酵溫度一定時(shí),食鹽添加量與接種量?jī)蓚€(gè)因素之間交互作用顯著,食鹽添加量在高水平時(shí),酸甘藍(lán)綜合品質(zhì)的響應(yīng)拋物曲線的最高點(diǎn)也處在較低水平,而隨著食鹽添加量的下降,酸甘藍(lán)綜合品質(zhì)的響應(yīng)拋物曲線的最高點(diǎn)向高水平方向移動(dòng)。當(dāng)接種量一定時(shí),隨著食鹽添加量的增加,酸甘藍(lán)綜合品質(zhì)先升高后降低,說(shuō)明在低濃度食鹽時(shí)有利于接種乳酸發(fā)酵,鹽濃度過(guò)大增大反而抑制乳酸菌的生長(zhǎng)。
圖2 食鹽添加量與發(fā)酵溫度交互作用的響應(yīng)面和等高線Fig.2The response surface and contour of the interaction between salt content and fermentation temperature
由圖2可知,當(dāng)接種量一定時(shí),食鹽添加量與發(fā)酵溫度的交互作用不顯著。當(dāng)食鹽添加量一定時(shí),發(fā)酵溫度在20~25℃,隨著發(fā)酵溫度的升高,酸甘藍(lán)的綜合品質(zhì)升高。發(fā)酵溫度在25~30℃,發(fā)酵溫度影響不顯著,隨著溫度的升高,酸甘藍(lán)的綜合品質(zhì)降低,因?yàn)榇藴囟确秶鸀槿樗峋倪m宜溫度,發(fā)酵快、時(shí)間短;但溫度過(guò)高,也易引起腐敗細(xì)菌、霉菌等有害微生物的生長(zhǎng),菜色澤變暗,風(fēng)味變差。
圖3 接種量與發(fā)酵溫度交互作用的響應(yīng)面與等高線Fig.3The response surface and contour of the interaction between inculum size and fermentation temperature
由圖3可知,當(dāng)食鹽濃度一定時(shí),接種量和發(fā)酵溫度交互作用顯著性較弱。酸甘藍(lán)綜合品質(zhì)主要由發(fā)酵溫度決定,隨著發(fā)酵溫度的升高,酸甘藍(lán)的綜合品質(zhì)先增大后減小。低接種量下,適宜的發(fā)酵溫度對(duì)酸甘藍(lán)綜合品質(zhì)有利,因?yàn)榻臃N量小、適宜的溫度可以使乳酸菌快速地生長(zhǎng)繁殖,并抑制其他雜菌的生長(zhǎng),促使乳酸發(fā)酵的進(jìn)行。
2.4.3 優(yōu)化結(jié)果與驗(yàn)證試驗(yàn)
將酸甘藍(lán)綜合品質(zhì)取最大值,通過(guò)Design Expert 7.1.3軟件自動(dòng)分析得到最優(yōu)條件:食鹽添加量1%、接種量5%、發(fā)酵溫度25℃,在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn),酸甘藍(lán)綜合品質(zhì)V達(dá)到0.838。
采用響應(yīng)面法對(duì)酸甘藍(lán)的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,建立的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型顯著性良好。酸甘藍(lán)發(fā)酵的最佳發(fā)酵工藝條件為食鹽添加量1%,接種量5%,發(fā)酵溫度25℃。在此發(fā)酵條件下,酸甘藍(lán)的感官品質(zhì)得分為88,含亞硝酸鹽0.02mg/kg、Vc 4.34mg/kg,pH為3.25,發(fā)酵時(shí)間23天。