秦智偉，于思琦，劉　東，辛　明，周秀艷

（1.農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱　150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，哈爾濱　150030）

黃瓜（Cucumis sativus L.），別名胡瓜、王瓜，為葫蘆科甜瓜屬一年生攀緣草本植物，起源于喜馬拉雅山脈熱帶地區(qū)[1]。黃瓜生產(chǎn)栽培常受各種病原菌侵染，影響產(chǎn)量和品質(zhì)。近年來，隨著世界保護(hù)地蔬菜栽培面積擴(kuò)大，為多種流行病害提供適宜生存環(huán)境，尋找抗病基因?qū)S瓜抗病性育種意義重大。

GASA基因家族是一類受GA調(diào)控的基因家族[2]。GASA蛋白結(jié)構(gòu)包含N-端信號(hào)肽序列，該序列通常由18～29個(gè)氨基酸殘基組成；信號(hào)肽后面是由7～31個(gè)極性氨基酸殘基組成的親水區(qū)域；C-端是約60個(gè)氨基酸組成的高度保守結(jié)構(gòu)域，即GASA結(jié)構(gòu)域[3]。GASA結(jié)構(gòu)域是GASA家族成員核心結(jié)構(gòu)域，Rubinovich和Sun等研究認(rèn)為，該結(jié)構(gòu)域缺失或保守半胱氨酸殘基突變均會(huì)導(dǎo)致GASA蛋白喪失功能[4-5]。張強(qiáng)等研究表明，GASA蛋白多數(shù)屬于分泌蛋白一類，該家族蛋白結(jié)構(gòu)相似，但功能各異[6]。Kotilainen等研究表明，同為GASA基因家族不同成員功能可能相同或相反，非洲菊GEG和PRGL基因在花瓣伸長(zhǎng)中表現(xiàn)相反功能——GEG基因通過抑制細(xì)胞伸長(zhǎng)而抑制花瓣尺寸[7]，PRGL基因則相反[8-9]。Shi等在赤霉素缺失的番茄突變體gib1中分離出的GAST1基因是首個(gè)GASA基因家族成員[10]。Herzog等在擬南芥中發(fā)現(xiàn)GASA基因家族[11]。矮牽牛[12]、非洲菊[7]、馬鈴薯[13]、水稻[14]、草莓[15]等中也有該家族基因。GASA蛋白在植物生長(zhǎng)發(fā)育階段[16-18]、非生物脅迫[12,19]、生物脅迫[13,20]及激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[5,21]中均有顯著作用。多數(shù)GASA家族基因受GA調(diào)控。赤霉酸（GA3）誘導(dǎo)矮牽牛后得到4個(gè)GIP同源基因高表達(dá)[12]；Furukawa等利用GA3促進(jìn)水稻和GA合成缺失突變體中OsGASR1和OsGASR2表達(dá)[14]。GASA家族基因在非生物、生物脅迫中作用也有研究，擬南芥GASA4基因超量表達(dá)后可提高轉(zhuǎn)基因植株耐熱性[22]；Snakin-2基因在機(jī)械損傷后顯著上調(diào)表達(dá)，Snakin-2超量表達(dá)后顯著提高病原體抵抗能力[13]。目前該家族基因在黃瓜育種中研究較少。

本研究選取霜霉病與棒孢葉斑病兩種病害脅迫下，在黃瓜抗病品種上調(diào)表達(dá)、感病品種下調(diào)表達(dá)的基因，作克隆及生物信息學(xué)分析，以期探明其基因序列結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系及理化性質(zhì)，為進(jìn)一步探究該基因功能及抗病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料

試驗(yàn)材料選取抗霜霉病和棒孢葉斑病雙抗品種D9320及雙感病品種D0401[23]。種子經(jīng)催芽處理12 h后，于2017年7月置于恒溫培養(yǎng)箱中白天溫度25～28℃，夜間溫度18～20℃，培養(yǎng)至兩葉一心。黃瓜種子由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院黃瓜課題組提供。提取RNA的Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、膠回收試劑盒、Taq酶、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，T3克隆載體購(gòu)自TaKaRa生物工程有限公司。

1.2　方法

1.2.1黃瓜總RNA提取與cDNA鏈合成

剪取約100 mg黃瓜新鮮葉片，加入液氮后充分研磨，采用Trizol法提取黃瓜總RNA。提取后通過凝膠電泳檢測(cè)RNA純度是否可用于后續(xù)試驗(yàn)。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，保存于-20℃冰箱待用。

1.2.2基因編碼區(qū)序列獲得

利用黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫（http://www.icugi.org/），輸入基因登錄號(hào)CSa3G826660，下載該基因編碼區(qū)序列。

1.2.3基因引物設(shè)計(jì)與合成

使用Primer Premier 5.0軟件作克隆基因編碼區(qū)全長(zhǎng)引物設(shè)計(jì)，上下游引物序列：CsGASA4-F，5'ATGGCGATGCCCAAGTTCGCTG 3'； CsGASA4-R，5'TTAAGGGCATTTGGGTCCTCCTTCC 3'。引物序列由哈爾濱博仕科技有限公司合成。

1.2.4基因克隆

利用RT-PCR擴(kuò)增目的片段，PCR反應(yīng)體系（20 μL）為：cDNA模板2.5 μL；SuperMix 11.5 μL，H2O44 μL；上下游引物各 1 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，55.3℃退火1 min，72℃延伸30 s，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶正確后，使用北京全式金膠回收試劑盒回收目的條帶。將回收片段連接T3載體，連接體系為：目的基因4 μL，T3連接酶1 μL，室溫（20～37℃）反應(yīng)5 min，反應(yīng)結(jié)束后采用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Tans1-T1，在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板上37℃過夜培養(yǎng)，篩選白色單菌落單獨(dú)培養(yǎng)，菌液PCR后，凝膠電泳檢測(cè)條帶正確，送蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.5編碼蛋白生物信息學(xué)分析

本研究主要利用生物信息學(xué)分析網(wǎng)站（如表1所示）預(yù)測(cè)編碼蛋白理化性質(zhì)、親疏水性、亞細(xì)胞定位、跨膜區(qū)域、信號(hào)肽及蛋白質(zhì)二三級(jí)結(jié)構(gòu)，為該基因功能解析提供依據(jù)。

2　結(jié)果與分析

2.1　黃瓜總RNA提取及檢測(cè)

采用Trizol法提取黃瓜葉片總RNA，凝膠電泳結(jié)果表明，RNA提取效果良好，基本無蛋白污染。凝膠電泳檢測(cè)條帶如圖1所示，28S、18S、5S 3條帶較清晰，且寬度比較適宜，黃瓜RNA提取效果可用于后續(xù)試驗(yàn)研究。

2.2　基因克隆

PCR程序擴(kuò)增得到目的產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖2。該片段長(zhǎng)度為315 bp。經(jīng)蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司測(cè)序，結(jié)果與黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫該基因CDS全長(zhǎng)序列通過NCBI中Blast對(duì)比后，相似度100%，測(cè)序結(jié)果與目的基因完全一致，無堿基發(fā)生突變，該基因已連接T3載體，表明克隆成功。

表1　生物信息學(xué)分析網(wǎng)站及功能預(yù)測(cè)Table 1　Website of bioinformatics analysis and function rediction

圖1　黃瓜總RNA提取Fig.1　Extract of cucumber RNA

圖2　CsGASA4基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2　PCR amplification production of CsGASA4

2.3　生物信息學(xué)分析

登陸黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫（http://www.icugi.org/）分析該基因結(jié)構(gòu)，顯示CsGASA4基因編碼區(qū)有4個(gè)外顯子，3個(gè)內(nèi)含子，編碼區(qū)全長(zhǎng)315 bp，起始密碼子ATG，終止密碼子TAA。通過Primer Premier 5.0將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，對(duì)編碼蛋白進(jìn)一步作生物信息學(xué)分析。

2.3.1蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

利用NCBI的Blast對(duì)比顯示該蛋白含有GASA super-family結(jié)構(gòu)域，第45個(gè)氨基酸到第104個(gè)氨基酸為GASA功能結(jié)構(gòu)域，屬于GASA家族蛋白，并將編碼該蛋白基因命名為CsGASA4（見圖3）。登陸 ProtParam（https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）分析氨基酸理化性質(zhì)，結(jié)果顯示CsGASA4蛋白由104個(gè)氨基酸組成，預(yù)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量11 458.74，理論等電點(diǎn)9.64，分子式C500H795N147O128S17，原子總數(shù)1 587，不穩(wěn)定系數(shù)34.12（不穩(wěn)定系數(shù)＜40時(shí)穩(wěn)定），屬于穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)54.52。

利用 Protscale（https://web.expasy.org/protscale/）預(yù)測(cè)基因編碼蛋白親疏水性，結(jié)果顯示，第13個(gè)氨基酸位置有最高疏水值3.511，第32個(gè)氨基酸位置有最大親水值-2.689，平均親水系數(shù)-0.183，為親水蛋白（見圖4）。

2.3.3CsGASA4蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

基因通過編碼蛋白行使功能，蛋白需處于細(xì)胞中特定亞細(xì)胞位置而發(fā)揮功能，蛋白質(zhì)位置與其功能密切相關(guān)，同樣蛋白亞細(xì)胞定位在一定程度上反映其對(duì)應(yīng)基因功能[24]。本研究利用蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位在線工具WoLF PSORT Prediction（https://www.genscript.com/psort.html）預(yù)測(cè)該蛋白位于分泌系統(tǒng)囊泡中（見表2）。

圖3　CsGASA4蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.3　Conserved domain of CsGASA4 protein

圖4　CsGASA4蛋白親疏水性預(yù)測(cè)Fig.4　Prediction of hydrophilicity and hydrophobicity of CsGASA4 protein

表2　PSORT預(yù)測(cè)CsGASA4蛋白亞細(xì)胞定位Table 2　Subcellular location of CsGASA4 protein based on PSORT

2.3.4CsGASA4蛋白跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)

利用TMHMM Sever v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）輸入CsGASA4蛋白序列在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)跨膜螺旋，結(jié)果顯示該基因編碼蛋白在前30個(gè)氨基酸位置有一個(gè)明顯跨膜區(qū)域，因此預(yù)測(cè)CsGASA4蛋白屬于跨膜蛋白（見圖5）。

2.3.5蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測(cè)

利用常用在線工具SignalP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測(cè)黃瓜蛋白信號(hào)肽。通常情況，信號(hào)肽在蛋白質(zhì)N端，極少超過45個(gè)氨基酸殘基。本研究對(duì)該基因編碼共104個(gè)氨基酸均分析信號(hào)肽。C值最大，S值陡峭，Y值最高峰位置預(yù)測(cè)為信號(hào)肽剪切位點(diǎn)。分析結(jié)果表明，第26和27個(gè)氨基酸之間位置有一個(gè)信號(hào)肽剪切位點(diǎn)，因此預(yù)測(cè)CsGASA4蛋白屬于分泌蛋白（見圖6）。

2.3.6基因編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.3.6.1蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

使用SPOMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在線工具預(yù)測(cè)CsGASA4蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白中62個(gè)氨基酸形成無規(guī)則卷曲占比最多，占比59.62%；36個(gè)氨基酸形成α螺旋，占比34.62%；有4條擴(kuò)展鏈，占比3.85%；還有2個(gè)形成β-折疊，占整條鏈1.92%（見圖7）。

圖5　CsGASA4蛋白TMHMM跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5　Tansmembrance domain of CsGASA4 protein predicted by TMHMM

圖6　CsGASA4蛋白SignalP-HMM信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.6　Signal peptide of CsGASA4 potein predicted by SignalP-HMM

圖7　CsGASA4蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.7　Prediction of secondary structure of CsGASA4 potein

2.3.6.2蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

登陸SWISS-MODEL（https://www.swissmodel.expasy.org/）網(wǎng)站預(yù)測(cè)該基因編碼蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)結(jié)果見圖8。

2.3.7系統(tǒng)進(jìn)化樹

登陸 NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載編碼蛋白為GASA家族蛋白其他物種13個(gè)基因，同源序列聚類分析，輸入MEGA軟件以Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（見圖9）。結(jié)果表明，黃瓜CsGASA4基因與大馬士革玫瑰FJ595792親緣關(guān)系最近，序列同源性達(dá)79%，屬1個(gè)分支；與矮牽牛（AJ417391、AJ417390、AJ417389）、擬南芥（AT1G74670、AT5G15230）、玉米AY103785親緣關(guān)系較近；與歐亞花魁AF060569親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖8　蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.8　Prediction of tertiary structure of CsGASA4 protein

圖9　蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.9　Analysis of protein system phylogenetic tree

3　討論與結(jié)論

GASA基因家族是植物特有基因。GASA蛋白是植物特有一類小分子蛋白，多數(shù)成員由80～120個(gè)氨基酸組成，也有少數(shù)成員氨基酸較多，擬南芥AtGASA14蛋白由245個(gè)氨基酸組成。GASA蛋白生物學(xué)功能主要表現(xiàn)在參與植物防御反應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育、響應(yīng)植物激素、調(diào)控植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程、參與氧化還原反應(yīng)等。張盛春等研究表明，擬南芥GASA基因家族包含15個(gè)基因，該家族成員均有一個(gè)信號(hào)肽，長(zhǎng)度約20個(gè)氨基酸，且信號(hào)肽后均有一個(gè)剪切位點(diǎn)，預(yù)測(cè)該家族蛋白屬于分泌型胞外蛋白，分析該家族蛋白功能結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，其中14個(gè)成員均含有一個(gè)保守GASA結(jié)構(gòu)域，其中GASA13蛋白除含一個(gè)GASA結(jié)構(gòu)域外還含一個(gè)PRP結(jié)構(gòu)域，PRP結(jié)構(gòu)域是細(xì)胞壁蛋白重要特征之一[25]。截至目前，擬南芥15個(gè)GASA基因家族中，GASA4基因功能闡明較全面。

目前報(bào)道水稻GASA家族中有9個(gè)同源基因，其 中 OsGSR1、 OsGASR1、 OsGASR2、 OsGASR3、OsGASR4在時(shí)空表達(dá)模式、激素調(diào)節(jié)及分子機(jī)制等方面均有相關(guān)研究。羅曼研究表明外源GA3對(duì)Os-GASR1和OsGASR2基因表達(dá)無影響，但可促進(jìn)Os-GASR3基因表達(dá)，抑制OsGASR4基因表達(dá)。OsGSR1、 OsGASR1、 OsGASR2、 OsGASR3、 Os-GASR4基因在水稻生長(zhǎng)發(fā)育過程中有不同功能。OsGASR1在多數(shù)幼嫩組織及代謝旺盛部位表達(dá)；OsG4SR3在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期僅在幼根中表達(dá)，在生殖生長(zhǎng)時(shí)期則主要在穎花中表達(dá)；OsG4SR4在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期僅在幼莖節(jié)中表達(dá)，在生殖生長(zhǎng)時(shí)期主要在花序中表達(dá)[26]。GASA蛋白多數(shù)定位于細(xì)胞壁和質(zhì)外體中，F(xiàn)urukawa等研究表明，水稻OsGASR1、OsGASR2位于細(xì)胞壁[14]，Zhang等試驗(yàn)表明，擬南芥GASA5定位于細(xì)胞壁或細(xì)胞外基質(zhì)[19]。本研究中預(yù)測(cè)黃瓜CsGASA4基因亞細(xì)胞定位于分泌系統(tǒng)囊泡中，尚待后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證。

GASA基因家族編碼蛋白主要有3個(gè)特征：靠近C-端有GASA家族結(jié)構(gòu)域、親水區(qū)結(jié)構(gòu)、N-端信號(hào)肽[27]。本研究分析結(jié)果表明CsGASA4基因具有該家族典型特征。有關(guān)GASA家族基因研究中，通常研究其在生長(zhǎng)發(fā)育各階段功能，外部激素誘導(dǎo)后植株響應(yīng)，但有關(guān)病害脅迫中該家族基因功能研究較少。本文篩選經(jīng)霜霉病和棒孢葉斑病兩種病原菌脅迫后，在抗病品種中上調(diào)表達(dá)、感病品種中下調(diào)表達(dá)基因之一，編號(hào)為Csa3G826660，該基因?qū)儆贕ASA蛋白家族，命名為CsGASA4。本研究成功克隆獲得黃瓜CsGASA4基因，明確其保守結(jié)構(gòu)域、編碼蛋白、亞細(xì)胞定位等生物信息，為后續(xù)研究黃瓜CsGASA4基因?qū)煞N病害脅迫響應(yīng)、功能分析及抗病機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。