劉艷龍，徐國海

(1、南昌大學醫(yī)學院，南昌 330006；2、南昌大學第二附屬醫(yī)院，南昌 330006)

隨著國家二胎政策的開放，新生兒每年出生增加近千萬。嬰幼兒接受各種檢查和手術麻醉操作增加。研究表明，麻醉藥物能夠導致兒童學習及行為異常的發(fā)生率增加[1，2]。一項前瞻性性臨床研究，通過調查測試麻醉術后兒童是否出現(xiàn)尿床，夢魘，壞脾氣，社交恐懼等，發(fā)現(xiàn)3歲以下嬰幼兒在接受全身麻醉后會引起行為改變比例最高，提示全麻藥物對嬰幼兒的中樞神經系統(tǒng)產生神經毒性[3]。因此我們在解決新生兒及兒童引起的相關臨床問題時，藥物對學習記憶的影響更應引起重視。

糖皮質激素可誘導通過抑制炎癥介質合成及炎癥細胞活性，穩(wěn)定溶酶體，修復血腦屏障等起重要作用，降低神經炎性反應和減少神經細胞凋亡，有一定的腦保護作用，廣泛運用于臨床。近年來BDNF與皮質激素的關系受到關注，但所知甚少。本研究通過觀察地塞米松聯(lián)合氯胺酮麻醉手術后對學習記憶的影響及其可能機制，為臨床嬰幼兒麻醉的藥物選擇提供理論基礎和參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 出生21d SD幼鼠48只，雌雄不拘。由南昌大學實驗動物實驗室提供，體重100-120g。實驗大鼠處置嚴格按照科技部2006年頒發(fā)的《善待實驗動物指導性意見》執(zhí)行。

1.1.2藥物，試劑和儀器 地塞米松（河南潤弘制藥股份有限公司），氯胺酮（西安漢豐藥業(yè)有限責任公 司 ）；TUAnti-BDNF antibody [EPR1292](ab108319，RabMAB)；Rabbit聚合 HRP 標記抗兔IgG(SV0002， 博士德)；5%BSA 封閉液(SW3015，Solarbio)；DAB 顯色試劑盒(CW0125，CWBIO)；中性樹脂(CW0136，CWBIO)；蘇木素染色(AR1180-1，博生德生物)NEL檢測試劑盒 （C1086，碧云天），Morris水迷宮及視頻分析軟件。

1.2方法

1.2.1實驗分組及建模 將SD幼鼠（100-120g）48只隨機分成3組，空白對照組，氯胺酮組，氯胺酮+地塞米松組，腹腔注射給藥翻正反射消失后，于上腹部中線附近備皮，常規(guī)消毒鋪巾，于正中線做一長約1.5cm切口，探查腹部5min，關腹，傷口用縫線縫合，傷口縫合后紅霉素軟膏涂抹，所有手術均嚴格按照無菌操作。手術結束后，待幼鼠翻正反射恢復后放回籠子，飼養(yǎng)，自由光照，室溫(23±2)℃，藥物處理后第1d各組斷頭（8只）取海馬組織，固定保存。剩余8只SD幼鼠藥物處理后第2d行Morris水迷宮定向航行實驗和空間探索實驗。

1.2.2水迷宮實驗 定位航行實驗：藥物處理后第2d后進行水迷宮適應性訓練。將SD幼鼠放入水槽自由游泳2min，使其適應迷宮內、外環(huán)境及游泳狀態(tài)。訓練期間每只小鼠每天進行4次訓練，記錄小鼠從入水到爬上平臺所需時間。如果小鼠在90s內仍未找到平臺，則將其引導至平臺并停留10s，潛伏期記為90s?？臻g探索實驗：在定位航行4d結束后，為考察SD幼鼠對原平臺的記憶能力，撤去平臺，將SD幼鼠放入水中自由游泳，記錄SD幼鼠在90s內穿過平臺所在象限的游泳時間和路徑，以及小鼠穿過平臺所在象限的次數(shù)

1.2.3TUNEL法檢測凋亡 將海馬組織石蠟切片脫蠟，水化預處理。將切片移入濕盒中，每個樣本上滴加50ug/mlProteinase K工作液修復。PBS充分洗滌。用吸水紙吸掉組織周圍的PBS，滴加TUNEL檢測液，孵育2h。再次PBS洗滌3次，用吸水紙吸干玻片上的液體，用抗熒光淬滅封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4免疫組化 將海馬組織石蠟切片脫蠟，水化預處理后切片放入修復盒中，加入抗原修復液(檸檬酸緩沖液)，加熱2min后自然冷卻，棄去抗原修復液，將切片用PBS淋洗。將切片移入濕盒中，加入新鮮配制的3%雙氧水，以去除內源性過氧化物酶封閉液，室溫孵育10min，PBS充分淋洗。PBS浸洗玻片3次吸，用水紙吸干組織周圍的PBS，在玻片上滴加5%BSA，37°C封閉30min。敷一抗：用吸水紙吸掉組織周圍的封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗：BDNF(1：100)，放入濕盒中，4°C孵育過夜。敷二抗：取出4°C孵育過夜?jié)窈?，室溫靜置45min，PBS浸洗玻片3次，每次5min，滴加聚合HRP標記抗兔IgG二抗工作液，37°C孵育30min，PBS充分淋洗。DAB顯色5-10 min，在顯微鏡下掌握染色程度，PBS或自來水沖洗1min；蘇木精復染3min，鹽酸酒精分化，返藍；自來水沖洗1min，脫水、透明、封片、鏡檢。

1.2.5RT-PCR法測定BDNFmRNA⑴組織樣品的處理：將組織樣品研磨至粉末狀，保持在低溫狀態(tài)。按照組織量加入對應量的Trizon Reagent。研磨至半固體半液體狀，用移液槍收集到標有分組的1.5ml離心管中。⑵提取RNA向以離心管中加入氯仿離心，樣品分成3層：紅色有機相層，中間層，上層無色水相層。取水相層（約900ul）到一個新的1.5ml RNase-Free離心管中。在水相溶液中加入70%乙醇，顛倒混勻，裝入收集管的吸附柱RM中，離心，洗滌后室溫放置5min晾干。將吸附柱置于一個新的1.5ml RNase-Free離心管中，加入無RNase的水，充分溶解RNA，靜置，離心，靜置。得到的RNA保存在-80℃，防止降解。⑶RNA濃度、純度測定：打開紫外可見分光光度計預熱20min，將RNA溶液與RNase free water混合均勻，在260 OD下測定其數(shù)據(jù)，再在280 OD下測定數(shù)據(jù)，最后根據(jù)公式計算A260×稀釋倍數(shù)×40=RNA ng/ul（濃度）A260/280≥1.8（純度）。將RNA通過逆轉錄HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒合成CDNA：渦旋震蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。 加入 dNTP Mix，Primer Mix，RNA Template后70℃孵育 10min，再迅速冰浴2min。再加入5xRT Buffer，DTT，HiFiScript 50℃孵育 15min，85℃孵育5min。反應結束后，短暫離心，置于冰上冷卻。⑷熒光定量PCR引物序列BDNF F：AGCCTCCTCT GCTCTTTCTG BDNF R：GTGACCCACTCGCTAAT ACTGT GAPDH F：GCAAGTTCAACGGCACAG GAPDH R：CGCCAGTAGACTCCACGAC與操作體系 RNase Free dH20 9.5μl，cDNA/DNA 1μl，上游引物 1μl下游引物 1μl，2xULtraSYBR Mixture 2.5μl通過三步法反應程序融解曲線分析。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析處理。計量資料以均數(shù)±標準差表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。幼鼠行為學結果采用重復測量設計的方差分析，TUNEL法檢測凋亡，RTPCR法測定BDNF及BDNFmRNA的表達采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，P

2　結果

2.1臨床觀察結果 出生21d SD幼鼠隨機分組，組間體重無統(tǒng)計學差異 （P>0.05）。腹腔注射給藥后，所有幼鼠生命體征平穩(wěn)，幼鼠皮膚顏色與對照組一樣均呈粉紅色，未發(fā)現(xiàn)有缺氧情況。實驗過程順利，幼鼠無不良事件發(fā)生。實驗結束后，幼鼠均能迅速從麻醉狀態(tài)中恢復。麻醉恢復后，幼鼠均能正常覓食，無神經系統(tǒng)受損表現(xiàn)。

2.2Morris水迷宮實驗

2.2.1定位航行實驗 如圖所示，各組幼鼠在訓練過程中，均隨著訓練天數(shù)的增加(每天訓練強度固定)，在水中逃逸、尋找平臺的潛伏期越來越短，直至達到穩(wěn)定水平，具體數(shù)據(jù)見（表1）。

表1　各組大鼠平均逃避潛伏期的比較（n=8，x±s）

2.2.2空間探索試驗 3組幼鼠空間探索的3項檢測結果（見表2）。穿越平臺次數(shù)的順位為A組>C組>B組，各組間差異有統(tǒng)計學意義（*P<0.05）。與氯胺酮組比較，地塞米松+氯胺酮組穿越平臺的次數(shù)增加(#P<0．05)。

表2　各組幼鼠穿越平臺次數(shù)的比較（n=8，x±s）

2.3TUNEL法檢測凋亡 光鏡下對照組僅見散在的凋亡細胞，用藥各組可見凋亡細胞增加，其中B組凋亡細胞增加最為明顯。

2.4免疫組化測定BDNF海馬組織勻漿中BDNF表達水平對照組最高，用藥各組可見BDNF含量下降，其中B組BDNF下降最為明顯（棕色為檢測的目的蛋白，藍紫色為細胞核）。B氯胺酮組和C組氯胺酮+地塞米松組海馬勻漿中BDNF均較對照組下降 (P<0.05)，其中C組海馬勻漿中BDNF含量較B組升高(P<0.05)。

2.5RT-PCR法BDNFmRNA本實驗采用RTPCR擴增來反映上述3個基因的相對定量表。海馬組織勻漿中BDNFmRNA表達水平對照組最高，用藥各組可見BDNFmRNA含量下降，其中B組BDNFmRNA下降最為明顯。

3　討論

本研究中，氯胺酮麻醉手術后，幼鼠行為學與對照組比較有統(tǒng)計學意義，其逃逸潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)減少。說明氯胺酮對幼鼠麻醉手術后學習記憶下降。其海馬神經元細胞凋亡指數(shù)高于對照組 (P<0.05)，而海馬勻漿中BDNF水平及BDNFmRNA低于對照組，據(jù)此我們推斷氯胺酮麻醉手術后誘導發(fā)育期幼鼠海馬神經元凋亡，導致幼鼠學習記憶功能的改變，導致這一結果的原因可能與氯胺酮下調了對神經元存活以及突觸形成起重要作用的BDNF蛋白的表達，神經元凋亡增加，突觸形成受損。這與譚蕾[4]等研究表明氯胺酮可抑制CREB磷酸化后下調BDNF及Bel-2表達影響神經系統(tǒng)的發(fā)育相一致。

糖皮質激素及其受體分布廣泛、作用復雜，在維持神經系統(tǒng)功能方面扮演了一個重要角色。它不僅對消炎，免疫抑制起作用，還是一種神經遞質，對腦功能有廣泛調節(jié)作用。而地塞米松是臨床上最常用的一種激素，是人工合成的糖皮質激素，主要與皮質醇受體結合而發(fā)生類似皮質醇的作用，對各種基因進行轉錄，并導致腦內的若干事件，包括細胞內信號轉導、新陳代謝和突觸可塑性，這些都與認知功能有關。許多研究表明，地塞米松可以影響記憶和學習過程的改變[5，6]。雖然人們普遍認為地塞米松會減少認知功能[7]，但一些研究提供了其他的證據(jù)。如如地塞米松能顯著縮短感覺阻滯起效時間，延長阻滯持續(xù)時間和鎮(zhèn)痛持續(xù)時間[8]，降低術后惡心嘔吐等不良反應的發(fā)生[9]。地塞米松可通過降低TNF-a、TGF-b、IL-6表達來抑制炎癥的發(fā)生[10]。此外，有研究表明地塞米松可逆轉記憶障礙。妊娠期地塞米松暴露可激活轉錄因子細胞反應元素結合蛋白結合，增加腦源性神經營養(yǎng)因子和c-FOS蛋白水平，調控突觸可塑性和記憶的關鍵因子，改善認知和tau病理，對學習記憶提供長期的保護[11]。本研究中，氯胺酮聯(lián)合地塞米松麻醉手術后，幼鼠行為學與氯胺酮組比較有統(tǒng)計學意義，其逃逸潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增加。說明地塞米松改善氯胺酮麻醉手術后學習記憶的影響。本研究中幼鼠地塞米松聯(lián)合氯胺酮組幼鼠海馬神經元細胞凋亡指數(shù)低于氯胺酮組(P<0.05)，而海馬勻漿中BDNF水平及BDNFmRNA高于氯胺酮組。有研究表明神經營養(yǎng)因子，如腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)，是與特定Trk酪氨酸激酶跨膜受體結合的肽激素，促進神經網(wǎng)絡的生存、生長和可塑性[12]。與糖皮質激素一樣，BDNF水平的變化與許多精神疾病相關，包括抑郁和焦慮，而抑郁和焦慮都影響學習記憶。最近的證據(jù)表明，BDNF和糖皮質激素在神經系統(tǒng)中有趨同的、平衡的效應[13，14]。Jeanneteau F[15]等研究顯示糖皮質激素通過一個GR轉錄機制，可以獨立于神經營養(yǎng)因子激活TrkB信號?？梢韵胂?，在GR和BDNF-TrkB信號之間存在一個交互的自我平衡的感知機制，以調節(jié)BDNF的轉錄輸出。通過本研究我們可以推測氯胺酮麻醉手術后下調BDNF的表達，而地塞米松的處理通過GR和BDNF-TrkB信號之間自我平衡的感知機制提高BDNF的表達，改善學習記憶。

綜上所述，氯胺酮對幼鼠麻醉手術后學習記憶下降，地塞米松可以提高BDNF的表達改善氯胺酮麻醉手術后對學習記憶影響。