金立新 陳明

脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2（Lipocalin2，也被稱作SIP24，24p3，或 NGAL）,Lipocalin家族的新成員，是新近報(bào)道的調(diào)控E-cad表達(dá)的重要因子[1]，在維持腎小球基底膜的正常代謝功能，促進(jìn)胚胎間充質(zhì)細(xì)胞向腎小管上皮細(xì)胞分化及哺乳動物近端腎單位發(fā)育過程中的間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)換過程中起重要作用。然而，Lipocalin2可否通過調(diào)節(jié)E-cad的表達(dá)而抑制TEMT過程，從而抑制腎小管間質(zhì)纖維化值得進(jìn)一步研究。我們根據(jù)基因文庫中Lipocalin2基因（登錄號BC033089）的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增Lipocalin2基因全編碼區(qū)，定向克隆入質(zhì)粒pEGFP-C3 中，利用脂質(zhì)體（Lipofectamine 2000 Reagent）介導(dǎo)，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HK-2細(xì)胞中，為進(jìn)一步研究Lipocalin2在人腎近曲小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 人腎近曲小管上皮細(xì)胞株（HK-2），來源于American Type Culture Collection （ATCC）由重慶醫(yī)科大學(xué)腎內(nèi)科惠贈。限制性內(nèi)切酶Bam H I、Xho I、T4 DNA 連 接 酶、DL2000DNA marker、pEGFP-C3載體、Lipofectamine 2000 Reagent均購自Invitrogen公司， 抗人Lipocalin2單抗購自R&D公司；RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA凝膠純化試劑盒、瓊脂粉、抗生素購自北京Tiangen公司；胰蛋白胨和酵母粉提取物為美國Gibco公司產(chǎn)品。大腸桿菌DH5a菌株（瀘州醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1lipocalin2基因的合成 根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的Lipocalin2基因的cDNA序列（基因文庫登錄號BC033089）設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增Lipocalin2基因全編碼區(qū)，全長597bp。根據(jù)Lipocalin2基因和真核表達(dá)載體pEGFP-C3的基因序列、蛋白編碼框架及起始、終止密碼子的位置，選用Xho I 、Bam H I作為亞克隆時酶切位點(diǎn)，引物設(shè)計(jì)如下：

PCR擴(kuò)增目的基因，電泳鑒定后，參照天根公司的普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書收集DNA溶液，測定其濃度，保存-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 將擴(kuò)增的目的基因Lipocalin2和空載體pEGFP-C3質(zhì)粒用Xho I和Bam H I進(jìn)行雙酶切，取5μl行瓊脂糖凝膠電泳，用DNA凝膠純化試劑盒回收質(zhì)粒載體后定量，按照目的基因∶載體為3∶1、T4DNA連接酶、10 x連接緩沖液，總反應(yīng)體積為10μl，16℃連接過夜。再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增，參照天根質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，Xho I和Bam H I雙酶切重組質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并將陽性克隆提取質(zhì)粒后送上海生工生物技術(shù)公司對重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定并將重組質(zhì)粒命名為pEGFP-C3-Lipocalin2。

1.2.3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞 選擇對數(shù)增長期生長狀態(tài)良好的HK-2細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，以5×105個接種到6孔板中，24h后細(xì)胞長到60%～70%左右融合，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照脂質(zhì)體試劑說明書操作，轉(zhuǎn)染后48h加入篩選抗生素G418（800ng/ml）持續(xù)培養(yǎng)14d后，挑出單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，同時設(shè)對照組細(xì)胞。

1.2.4RT-PCR檢測Lipocalin2 mRNA的表達(dá) 分別取轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-Lipocalin2及空載體pEGFP-C3的細(xì)胞，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA（按RNA抽提試劑盒說明書操作），逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增Lipocalin2基因，10g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠電泳成像系統(tǒng)分析。

1.2.5Western blotting檢測Lipocalin2 蛋白的表達(dá) 分別取轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-Lipocalin2及空載體pEGFP-C3的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，同時加入蛋白酶抑制劑PMSF（100mg/L）和抗氧化劑β-巰基乙醇（1mg/L），蛋白樣品在100℃變性5min，用12ml/L聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔上樣30μg。電泳后用電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫下（洗好膜后）用5mg/L脫脂奶粉（DSM，in TBST），封閉 2h，分別一抗 4℃過夜 ,洗膜后加入二抗，室溫孵育2h，應(yīng)用發(fā)光液（PIERCE）顯色，凝膠成像儀與Quangtity one軟件照相顯影。

2　結(jié)果

2.1Lipocalin2全序列PCR擴(kuò)增后電泳鑒定Lipocalin2全序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠電泳成像系統(tǒng)分析，在597bp左右可見一條清晰的條帶，與DNA Maker相比，擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)測結(jié)果一致，見圖1。

圖1　Lipocalin2全序列電泳鑒定

2.2重組質(zhì)粒pEGFP-C3-Lipocalin2的酶切鑒定重組質(zhì)粒pEGFP-C3-Lipocalin2用限制性內(nèi)切酶Xho I和Bam H I酶切后，10g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠電泳成像系統(tǒng)分析，可見位于597bp和4700bp處的兩條清晰的條帶，與DNA Maker相比，產(chǎn)物大小與理論結(jié)果一致，見圖2。

圖2　重組質(zhì)粒pEGFP-C3-Lipocalin2酶切鑒定

2.3重組質(zhì)粒pEGFP-C3-Lipocalin2的測序鑒定測序結(jié)果經(jīng)blast分析與基因文庫所提供序列一致，基因序列：ATGCCCCTAGGTCTCCTGTGGCTGGGC CTAGCCCTGTTGGGGGCTCTGCATGCCCAGGCCC AGGACTCCACCTCAGACCTGATCCCAGCCCCACC TCTGAGCAAGGTCCCTCTGCAGCAGAACTTCCAG GACAACCAATTCCAGGGGAAGTGGTATGTGGTAG GCCTGGCAGGGAATGCAATTCTCAGAGAAGACAA AGACCCGCAGAAGATGTATGCCACCGTCTATGAG CTGAAAGAAGACAAGAGCTACAATGTCACCTCCG TCCTGTTTAGGAAAAAGAAGTGTGACTACTGGAT CAGGACTTTTGTTCCAGGTTGCCAGCCCGGCGAG TTCACGCTGGGCAACATTAAGAGTTACCCTGGAT TAACGAGTTACCTCGTCCGAGTGGTGAGCACCAA CTACAACCAGCATGCTATGGTGTTCTTCAAGAAA GTTTCTCAAAACAGGGAGTACTTCAAGATCACCC TCTACGGGAGAACCAAGGAGCTGACTTCGGAACT AAAGGAGAACTTCATCCGCTTCTCCAAATCTCTGG GCCTCCCTGAAAACCACATCGTCTTCCCTGTCCCA ATCGACCAGTGTATCGACGGCTAG，提示重組質(zhì)粒pEGFP-C3-Lipocalin2構(gòu)建成功。

2.4轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-Lipocalin2及空載體pEGFP -C3的細(xì)胞的鑒定

2.4.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 以488nm波長激發(fā)光激發(fā)，激光共聚焦顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-Lipocalin2及空載體pEGFP-C3的細(xì)胞呈立方形或球形，具有典型的上皮細(xì)胞鋪路石樣特征，均發(fā)綠色熒光，轉(zhuǎn)染pEGFP-C3細(xì)胞熒光主要集中在細(xì)胞核，而轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-Lipocalin2細(xì)胞熒光均勻分布在胞漿胞核，見圖3。

圖3　pEGFP-C3-Lipocalin2及空載體pEGFP-C3在細(xì)胞中的表達(dá)

2.4.2Lipocalin2 mRNA表達(dá)檢測 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)分析，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-Lipocalin2、空載體pEGFP-C3細(xì)胞及對照組細(xì)胞在600bp左右均可見一條清晰的條帶，與DNA Maker相比，擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)測結(jié)果一致，且穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-Lipocalin2的細(xì)胞Lipocalin2 mRNA表達(dá)明顯高于空載體pEGFP-C3細(xì)胞及空白對照組細(xì)胞，初步提示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-Lipocalin2及空載體pEGFP-C3的細(xì)胞篩選成功，見圖4。

圖4　Lipocalin2基因電泳鑒定

2.4.3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-Lipocalin2及空載體pEGFP-C3細(xì)胞Lipocalin2蛋白表達(dá)檢測 Western blot結(jié)果顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-Lipocalin2、空載pEGFP-C3細(xì)胞及空白對照組細(xì)胞在25KD左右均可見一條清晰的條帶，與蛋白Maker相比，產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果一致，且穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-Lipocalin2的細(xì)胞Lipocalin2蛋白表達(dá)明顯高于空載體pEGFP-C3的細(xì)胞，進(jìn)一步提示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-Lipocalin2及空載體pEGFP-C3的細(xì)胞篩選成功，見圖5。

圖5　Lipocalin2蛋白表達(dá)鑒定

3　討論

Lipocalin2（也被稱做 NGAL/24p3）是 Kjeldsen等1993年在中性粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種脂質(zhì)運(yùn)載蛋白，廣泛分布于腎、支氣管、胃、小腸、胰腺等組織中，參與鐵及脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)凋亡的發(fā)生，抑制細(xì)菌的生長，參與炎癥趨化的調(diào)節(jié)。Jiang等[2]在研究中發(fā)現(xiàn)，Lipocalin2可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)分化，通過上調(diào)E-cad的表達(dá)使轉(zhuǎn)分化的乳腺腫瘤細(xì)胞恢復(fù)上皮細(xì)胞的形態(tài)，穩(wěn)定上皮細(xì)胞的表型而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和擴(kuò)散。Ratana等[3]發(fā)現(xiàn)Lipocalin2在上皮性卵巢腫瘤中明顯表達(dá)，而給予上皮生長因子誘導(dǎo)EMT使上皮性腫瘤向間質(zhì)性腫瘤轉(zhuǎn)變過程中，Lipocalin2表達(dá)減少，且與成纖維細(xì)胞的標(biāo)志—波形蛋白的表達(dá)相關(guān)，表明Lipocalin2參與維持了卵巢腫瘤的上皮表型。Ioannis等[4]在腎急性缺血-再灌注損傷模型過程中，局部缺血前、中、后期靜脈給予的重組Lipocalin2可顯著改善小鼠腎臟細(xì)胞的形態(tài)和功能，并可顯著減少小管細(xì)胞組織病理學(xué)損傷及降低血清肌酐水平，其機(jī)制可能如下：①Lipocalin2作為鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與了損傷后腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)和誘導(dǎo)血紅素加氧酶的生成，從而有利于損傷小管的再生；②Lipocalin2結(jié)合鐵而抑制E-cad磷酸化使E-cad降解減少[1]；③誘導(dǎo)腎小管-間質(zhì)中浸潤的中性粒細(xì)胞發(fā)生凋亡以保護(hù)腎組織免受炎細(xì)胞的侵害；④誘導(dǎo)腎間充質(zhì)細(xì)胞向腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，從而誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的再生[1]。研究發(fā)現(xiàn)Lipocalin2參與了哺乳動物近端腎單位發(fā)育過程中的間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)換過程，而腎臟發(fā)育的基本特征就是間質(zhì)細(xì)胞向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，Yang 等[5]分離小鼠的后腎間充質(zhì)細(xì)胞和輸尿管芽，用純化的、有活性的輸尿管芽處理后腎間充質(zhì)細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，細(xì)胞中E-cad快速表達(dá)，2～4d后細(xì)胞出現(xiàn)上皮形態(tài)學(xué)改變，7～9d后形成腎小管和腎單位，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)輸尿管芽中促進(jìn)胚胎間充質(zhì)細(xì)胞向腎小管上皮細(xì)胞分化的物質(zhì)就是Lipocalin2，表明Lipocalin2可通過促進(jìn)E-cad的表達(dá)而促進(jìn)胚胎間充質(zhì)細(xì)胞向腎小管上皮細(xì)胞分化。最新研究發(fā)現(xiàn)，Lipocalin2不僅作為急性腎小管損傷的早期標(biāo)志物[6，7]，在CKD中與腎臟損傷程度的關(guān)系日益受到重視[8～10]。但有關(guān)Lipocalin2在腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中的表達(dá)及意義，尚有待深入探討，含有Lipocalin 2基因的高表達(dá)的真核載體是深入研究的工作基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)選用的載體是pEGFP-C3，充分發(fā)揮了eGFP優(yōu)點(diǎn)：熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，穩(wěn)定性增加，持續(xù)時間延長，能長期持續(xù)觀察目的基因在HK-2活細(xì)胞中的表達(dá)；同時以pEGFP-C3為載體所構(gòu)建的重組質(zhì)?？梢栽诖竽c桿菌中擴(kuò)增，可轉(zhuǎn)染入哺乳動物細(xì)胞中。在構(gòu)建重組質(zhì)粒時，采用的是定向克隆的方法，采用這種定向克隆構(gòu)建重組質(zhì)粒有以下優(yōu)點(diǎn)：目的基因只以一個方向插入載體中，沒有了正、反篩選的問題；載體的兩個粘性末端不同，減少了載體自身環(huán)化的機(jī)率，故所得的陽性克隆多為重組質(zhì)粒；保留了目的基因和載體兩端的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，有利于重組質(zhì)粒的酶切鑒定。構(gòu)建好的重組質(zhì)粒經(jīng)限制性酶切和測序均說明Lipocalin2基因已連接到載體pEGFP-C3上，重組質(zhì)粒pEGFPC3-Lipocalin2構(gòu)建成功為下一步實(shí)驗(yàn)奠定了重要基礎(chǔ)。將外源性DNA導(dǎo)入細(xì)胞有瞬時轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染兩種方法，DNA轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)可以在1～4d內(nèi)檢測到，只有一部分細(xì)胞的DNA被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并最終輸出mRNA到細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行蛋白合成，為了進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)，轉(zhuǎn)入的目的基因必須在宿主細(xì)胞染色體上穩(wěn)定整合，故本實(shí)驗(yàn)采用了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法，使用Invitrogen公司生產(chǎn)的lipofectamine2000作為轉(zhuǎn)染試劑，將Lipocalin2基因?qū)際K-2細(xì)胞，G418篩選穩(wěn)定表達(dá)Lipocalin2基因的細(xì)胞株。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示pEGFP-C3-Lipocalin2及空載體pEGFP-C3被成功轉(zhuǎn)染入HK-2細(xì)胞中并表達(dá)，為下一步實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。