饒麗莎 王培 張家君 黃田盛 許珊珊 曹光球 林思祖
(福建農(nóng)林大學(xué), 福州,350002) (國(guó)家林業(yè)局杉木工程技術(shù)研究中心(福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院))
杉木(Cunninghamialanceolata(Lamb.) Hook.)是我國(guó)南方重要的速生用材樹(shù)種[1]。我國(guó)一些杉木主產(chǎn)區(qū)常年夏季高溫少雨,冬季寒冷干燥,極端低溫和干旱現(xiàn)象頻發(fā)且土壤富鐵鋁化嚴(yán)重[2]。因此,杉木在生長(zhǎng)過(guò)程中經(jīng)常遭受各種逆境脅迫(鋁毒害、低溫和干旱等),此類(lèi)環(huán)境因素限制了杉木的生長(zhǎng)。逆境脅迫容易引起植物體內(nèi)活性氧代謝失衡,導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧大量積累造成氧化損傷,最終使植物生長(zhǎng)受抑。逆境脅迫下,為保護(hù)細(xì)胞免受活性氧的傷害,植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中,建立了一套酶促和非酶促系統(tǒng)組成的抗氧化體系。超氧化物歧化酶(SOD)作為酶促抗氧化系統(tǒng)中重要的組成部分,在清除植物體內(nèi)超氧陰離子自由基,減輕其對(duì)細(xì)胞的損傷,維持細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能中起著十分關(guān)鍵的作用[3]。SOD是一類(lèi)廣泛存在于植物體內(nèi)的金屬酶類(lèi),根據(jù)金屬輔基的不同通常將SOD分為3種不同的類(lèi)型,即Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD[4]。研究表明在這3種不同類(lèi)型的SOD中,Mn-SOD在清除活性氧中尤為關(guān)鍵,是需氧生物生存必不可缺的一種SOD,與植物眾多抗逆性密切相關(guān)[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)煙草Mn-SOD基因轉(zhuǎn)化苜蓿(MedicagosativaLinn)植株,Mn-SOD活性顯著提高[7]。類(lèi)似的研究結(jié)果在水稻[8]中也有發(fā)現(xiàn),因此Mn-SOD基因?qū)τ谇宄钚匝蹙S持植物正常生理功能具有重要意義。近年來(lái)在芥菜(Brassicajuncea(L.) Czern. et Coss.)[9]、茄子(SolanummelongenaL.)[10]、茶樹(shù)(Camelliasinensis)[11]、小麥(TriticumaestivumL.)[12]、銀杏(GinkgobilobaL.)[13]、蓮(NymphaeaL.)[14]等植物中克隆獲得Mn-SOD基因并進(jìn)行了逆境脅迫下的表達(dá)分析,進(jìn)一步證實(shí)了Mn-SOD基因在調(diào)控植物對(duì)逆境脅迫耐性中具有重要作用。
目前對(duì)杉木Mn-SOD基因在逆境脅迫下的分子機(jī)理未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此,本研究根據(jù)已克隆的Mn-SOD基因序列,運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)探究不同逆境脅迫下杉木Mn-SOD基因的表達(dá)情況,為進(jìn)一步探究杉木Mn-SOD基因在逆境脅迫中的功能及抗逆育種的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。
以杉木020組培苗作為試驗(yàn)材料,選取長(zhǎng)勢(shì)大小一致的組培苗接種到MS液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)溫度25 ℃,濕度70%,光照周期為16 h光照/8 h黑暗,有效光輻射150 μmol·m-2·s-1。預(yù)培養(yǎng)1周后分別用4 ℃低溫、0.054 6 g·mL-1甘露醇、2 mmol·L-1鋁離子和300 mmol·L-1的NaCl進(jìn)行脅迫。采用3組重復(fù)試驗(yàn),取在未處理(CK)和脅迫培養(yǎng)下不同時(shí)間點(diǎn)的組培苗(低溫脅迫0、6、12、24、48、96 h;干旱脅迫0、12、24、48 h;鋁脅迫0、6、12、24、48 h;鹽脅迫0、12、24、48 h),取成熟未處理的杉木組培苗的根、莖和葉,用于組織特異性表達(dá)。液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱備用。
取100 mg杉木組培苗加入液氮迅速研磨,直至研磨成粉末狀,采用天根公司的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取總RNA。利用紫外分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量。采用TaKaRa生物公司的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈合成。
試驗(yàn)以杉木Actin為內(nèi)參基因,設(shè)計(jì)引物F1:5’-CAGCAACTGGGATGATATGG-3’,R1:5’-ATTTCGCTTTCAGCAGTGGT-3’;根據(jù)擴(kuò)增得到的杉木Mn-SOD基因設(shè)計(jì)引物F2:5’-TGACAGCCACTGTCTTGAAA-3’,R2:5’-ACTATTAAACCTCTCTGCCAGTT-3’。
qPCR反應(yīng)采用TaKaRa生物公司的SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒,在ABI7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行試驗(yàn)。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性5 s,60 ℃退火34 s,40個(gè)循環(huán)。
選用2-ΔΔCT法對(duì)目的基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算。其中:ΔΔCT=(試驗(yàn)組ΔCT)-(對(duì)照組ΔCT);試驗(yàn)組ΔCT=(試驗(yàn)組目的基因CT)-(試驗(yàn)組內(nèi)參基因CT)[15]。
提取各脅迫處理的杉木總RNA,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)圖1。RNA3條帶完整,28S的亮度為18S的2倍,5S的亮度最淡。OD值均在1.8~2.0,可知樣品總RNA完整性好,可進(jìn)行后續(xù)cDNA合成試驗(yàn)。
M為2000DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1為總RNA。
2.2.1不同脅迫下杉木Mn-SOD基因的表達(dá)
由表1可知,與對(duì)照組相比,短時(shí)間(6 h)低溫脅迫(4 ℃)處理能誘導(dǎo)Mn-SOD基因相對(duì)表達(dá)量增加;隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng),Mn-SOD基因相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì),當(dāng)?shù)蜏孛{迫時(shí)間達(dá)到12 h時(shí),Mn-SOD基因相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值,此時(shí)Mn-SOD基因相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照的47.94倍。繼續(xù)延長(zhǎng)脅迫時(shí)間至96 h內(nèi),Mn-SOD基因相對(duì)表達(dá)量則出現(xiàn)急劇下調(diào),盡管此時(shí)Mn-SOD相對(duì)表達(dá)量下降,但仍顯著高于對(duì)照處理,是對(duì)照組的18.65倍。
在干旱脅迫下,隨時(shí)間的推移,Mn-SOD基因的相對(duì)表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)。12 h時(shí)Mn-SOD基因相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)急劇上調(diào)且顯著高于對(duì)照組,是對(duì)照組的3.29倍。處理24 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量降低至對(duì)照組的0.85倍,繼續(xù)延長(zhǎng)脅迫時(shí)間至48 h,Mn-SOD基因的相對(duì)表達(dá)量仍呈下降趨勢(shì),是對(duì)照組的0.64倍。
經(jīng)2 mmol·L-1鋁離子脅迫,Mn-SOD基因的相對(duì)表達(dá)量隨著時(shí)間延長(zhǎng)總體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),且均顯著高于對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量。短時(shí)間(6 h)鋁脅迫就能誘導(dǎo)Mn-SOD基因表達(dá)量增加,當(dāng)鋁脅迫時(shí)間達(dá)到24 h的時(shí)候Mn-SOD基因表達(dá)量達(dá)到峰值,此時(shí)Mn-SOD基因表達(dá)量是對(duì)照的22.21倍。繼續(xù)延長(zhǎng)脅迫時(shí)間至48 h,Mn-SOD基因表達(dá)量呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì),盡管此時(shí)Mn-SOD表達(dá)量下降,但仍顯著高于對(duì)照處理。
鹽脅迫可在一定程度上破壞植物體內(nèi)的離子平衡和滲透壓,從而引起植物體內(nèi)代謝紊亂,導(dǎo)致活性氧積累,從而造成自由基傷害。杉木組培苗中Mn-SOD基因表達(dá)量在48 h內(nèi)呈顯著上升的趨勢(shì),相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組,12~24 h時(shí)Mn-SOD基因的相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照的9倍左右,在48 h時(shí)Mn-SOD基因相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值,此時(shí)Mn-SOD基因表達(dá)量是對(duì)照的33.88倍。
表1 不同脅迫下杉木Mn-SOD基因相對(duì)表達(dá)量
注:不同小寫(xiě)字母表示處理間顯著性水平P<0.05。
2.2.2杉木Mn-SOD基因的組織特異性表達(dá)
Mn-SOD基因在成熟未處理的杉木根、莖和葉中均有表達(dá),但相對(duì)表達(dá)量存在顯著差異。Mn-SOD基因在葉中表達(dá)水平最高,莖的相對(duì)表達(dá)量次之,在根中的相對(duì)表達(dá)量最低。將根中的Mn-SOD基因相對(duì)表達(dá)量作為對(duì)照,莖中的相對(duì)表達(dá)量為根的3.96倍,葉片中的相對(duì)表達(dá)量為根的4.93倍(表2)。
表2 杉木Mn-SOD基因在不同組織部位的相對(duì)表達(dá)量
注:不同小寫(xiě)字母表示處理間顯著性水平P<0.05。
在正常生長(zhǎng)條件下,植物體內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生和清除始終保持著動(dòng)態(tài)平衡,當(dāng)植物遭受外界脅迫時(shí),這種動(dòng)態(tài)平衡就會(huì)被打破,從而導(dǎo)致活性氧迅速積累。當(dāng)活性氧累積超過(guò)植物自身調(diào)節(jié)能力時(shí),就會(huì)發(fā)生膜脂過(guò)氧化并引發(fā)連鎖反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞膜系統(tǒng)受損,細(xì)胞內(nèi)組分外滲,引起代謝紊亂。為保護(hù)細(xì)胞免受活性氧的損害,在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中植物建立一套由酶性抗氧化系統(tǒng)(如超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶等)和非酶性抗氧化系統(tǒng)(如抗壞血酸和谷胱甘肽)組成的抗氧化防御體系[16]。超氧化物歧化酶是清除活性氧的第一道防線(xiàn),主要催化超氧物陰離子自由基(O2-)歧化形成過(guò)氧化氫(H2O2),隨后在過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶的作用下形成水,保護(hù)細(xì)胞免受傷害[17-18]。超氧化物歧化酶活性與植物的耐氧化性、耐旱性之間呈正相關(guān),且受到相應(yīng)超氧化物歧化酶基因的表達(dá)調(diào)控。植物轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),檉柳(TamarixchinensisLour.)中克隆的Mn-SOD基因轉(zhuǎn)化到酵母基因組中,其抗干旱、高溫能力明顯提高[19]。轉(zhuǎn)Mn-SOD基因仙客來(lái)(Cyclamenpersicum)植株對(duì)高溫脅迫的抗性也有所提高[20]。相同的結(jié)果在西伯利亞蓼(PolygonumsibiricumLaxm.)中也發(fā)現(xiàn),其PsMnSOD基因提高了酵母對(duì)鹽堿脅迫的抗性[21]。
本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下杉木組培苗中Mn-SOD基因表達(dá)也受到迅速誘導(dǎo)(6 h),在12 h時(shí)達(dá)到峰值,隨后其表達(dá)量迅速下降。導(dǎo)致基因Mn-SOD表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)的原因可能就是由于長(zhǎng)時(shí)間低溫脅迫導(dǎo)致杉木組培苗不可逆損傷,造成其抗寒能力下降。在48 h時(shí)Mn-SOD基因的表達(dá)量與對(duì)照差異不顯著,可能由于低溫脅迫基因響應(yīng)時(shí)間較短,脅迫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等原因,這與在研究低溫下茄子SmMnSOD基因的表達(dá)受到顯著抑制的結(jié)果相一致[10]。同時(shí)前人研究結(jié)果也表明,低溫脅迫能顯著誘導(dǎo)植物體內(nèi)SOD基因的迅速表達(dá),增強(qiáng)植物對(duì)低溫脅迫的抗性[22]。除了低溫脅迫可以迅速誘導(dǎo)Mn-SOD基因表達(dá),其他逆境脅迫同樣可誘導(dǎo)表達(dá),例如茶樹(shù)[11]和小麥[12]在干旱脅迫和鹽脅迫下均能顯著誘導(dǎo)Mn-SOD基因快速表達(dá),呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。與前人研究結(jié)果類(lèi)似,本研究中發(fā)現(xiàn)隨干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),杉木組培苗Mn-SOD基因表達(dá)量增加,12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高且顯著高于對(duì)照;24 h后表達(dá)量顯著降低,可推測(cè)杉木Mn-SOD基因在干旱脅迫一定時(shí)間內(nèi)能對(duì)杉木起到調(diào)節(jié)保護(hù)作用。而這種隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量下降的情況,可能是由于杉木自身較為敏感,長(zhǎng)時(shí)間脅迫處理使其體內(nèi)活性氧過(guò)量積累造成嚴(yán)重?fù)p失,引起細(xì)胞各部位代謝紊亂,從而最終引起該基因表達(dá)量下降。眾所周知,鋁脅迫迅速誘導(dǎo)活性氧在植物體內(nèi)積累,導(dǎo)致氧化損傷,抑制植物生長(zhǎng)。類(lèi)似地,鋁脅迫下杉木組培苗Mn-SOD基因表達(dá)量同樣呈上升趨勢(shì),而且其表達(dá)量均高于對(duì)照,說(shuō)明Mn-SOD基因在杉木應(yīng)對(duì)鋁脅迫過(guò)程中具有一定的作用。鹽脅迫下杉木組培苗Mn-SOD基因表達(dá)量變化幅度最大,脅迫48 h表達(dá)量上升33.88倍。由此可見(jiàn),不同逆境脅迫均能快速誘導(dǎo)杉木Mn-SOD基因表達(dá),而不同的脅迫方式調(diào)控機(jī)制不同,導(dǎo)致對(duì)脅迫的響應(yīng)時(shí)間和響應(yīng)程度不同。低溫和干旱脅迫可以較快地誘導(dǎo)Mn-SOD基因的表達(dá),均在12 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值,Mn-SOD基因在鋁脅迫下的表達(dá)量是波動(dòng)的,在24 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值,而Mn-SOD基因響應(yīng)鹽脅迫時(shí)間要長(zhǎng)于其他3種脅迫,在48 h達(dá)到峰值且顯著高于對(duì)照組。
同時(shí)本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析Mn-SOD基因在杉木組培苗根、莖和葉組織中的表達(dá)差異,豐富了Mn-SOD基因的表達(dá)規(guī)律。研究發(fā)現(xiàn)Mn-SOD基因在根、莖和葉均有表達(dá)。其中,Mn-SOD基因在杉木葉片有較高的表達(dá),而莖和根的表達(dá)量相對(duì)較低。前人研究表明,茄子(SolanummelongenaL.)中SmMnSOD基因在多個(gè)組織中均有表達(dá),其中葉片和花瓣中的表達(dá)量最高[10];杧果(Mangiferaindica)MiMnSOD基因在多個(gè)組織中表達(dá),其中在成熟葉片和果實(shí)中表達(dá)水平最高[23]。
本研究證實(shí)了杉木Mn-SOD基因能對(duì)不同逆境脅迫條件產(chǎn)生響應(yīng),暗示在逆境脅迫下,當(dāng)植物體內(nèi)細(xì)胞受到傷害時(shí),杉木可能通過(guò)誘導(dǎo)Mn-SOD基因的表達(dá),從而減輕逆境脅迫對(duì)杉木造成的傷害。研究結(jié)果為通過(guò)基因工程手段改良杉木抵抗逆境脅迫能力,增強(qiáng)杉木對(duì)逆境脅迫的耐性提供理論依據(jù)。