陳 圓，趙怡惠，黃 燕，李紅偉，范紅英，陳勇智

（惠州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 惠州 516007）

自20世紀(jì)70年代以來(lái)中國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率呈持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì).傳統(tǒng)的手術(shù)、化療技術(shù)會(huì)對(duì)人體造成極大的傷害，中西醫(yī)結(jié)合一直是我國(guó)醫(yī)療技術(shù)的特色，中藥在腫瘤的治療上確有顯著療效，且在某些方面可彌補(bǔ)西醫(yī)的不足，如抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞，減輕放化療毒副作用等［1］.因此結(jié)合中醫(yī)治療，開發(fā)新的抗腫瘤中藥成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn).

青風(fēng)藤是防己科植物青藤（Sinomenium acutum（Thunb.）Rehd.et wils）以及毛青藤（Sinomenium acutum（Thunb.）Rehd.et Wils.var.cinereum Rehd.et Wils）的干燥藤莖.青風(fēng)藤早在1000多年前就被用于治療風(fēng)濕類疾病［2］，在20世紀(jì)初日本學(xué)者從青風(fēng)藤中分離得到其主要成分——青藤堿［3］，青藤堿具有抗炎，免疫，鎮(zhèn)咳，降壓，抗心肌缺血的作用［4］，近年來(lái)，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)青藤堿還具有抗氧化，戒毒［5］，多種抗腫瘤活性［6-9］.現(xiàn)在的臨床藥物有正清風(fēng)痛寧片、鹽酸青藤堿注射液、毛青藤總堿、青藤堿緩釋劑等.青藤堿毒副作用較大，生物半衰期短，用藥劑量大，且容易引起過(guò)敏性休克，白細(xì)胞減少及胃腸道反應(yīng).

本實(shí)驗(yàn)以鹽酸青藤堿為對(duì)象，用Autoduck軟件篩選出鹽酸青藤堿在JAK/STAT1信號(hào)通路上可能的藥物靶點(diǎn)，然后通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)并分析藥物是否對(duì)蘇蕓金桿菌與金葡萄球菌的有生長(zhǎng)抑制活性和抗氧化活性.通過(guò)幾種不同溶劑（乙醇、丙酮、稀堿、氯仿）提取鹽酸青藤堿并檢測(cè)其對(duì)二苯代苦味?；―PPH），2，2’-連氨-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS）自由基清除能力及還原能力來(lái)評(píng)價(jià)其抗氧化性能，為鹽酸青藤堿的藥用機(jī)制研究及天然抗氧化劑開發(fā)提供科學(xué)依據(jù).

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

蘇蕓金桿菌、金葡萄球菌：由惠州學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供.

鹽酸青藤堿：湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司提供.

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1濾紙片藥液浸泡的方法

參照采用濾紙片藥液浸泡的方法［10］.

1.2.2抑菌圈的測(cè)量

觀察含藥紙片周圍有無(wú)抑菌圈，用直尺以十字交叉法測(cè)定其抑菌圈直徑（包括紙片直徑），一毫米為單位記錄數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用抑菌圈取平均值［11-12］.

1.2.3抗氧化活性的測(cè)定方法

參照鹽酸青藤堿不同提取物的抗氧化活性的方法［13-14］.

用DPPH法和ABTS法檢測(cè)以乙醇（95%）、丙酮、稀堿提取物的鹽酸青藤堿的抗氧化活性.

1.2.4藥物靶點(diǎn)篩選

運(yùn)用Autoduck軟件篩選出鹽酸青藤堿與JAK/STAT信號(hào)通路的藥物靶點(diǎn).

2　結(jié)果與分析

2.1　鹽酸青藤堿藥物靶點(diǎn)篩選結(jié)果

篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JAK1的結(jié)合活性位點(diǎn)為arg879、leu881、gly882、glu883、gly884殘基，鹽酸青藤堿與這些位點(diǎn)發(fā)生對(duì)接結(jié)合，總共做了100個(gè)對(duì)接，選取其中最優(yōu)十個(gè)對(duì)接構(gòu)象，結(jié)合能分別為-8.46，-8.08，-7.66，-7.62，-7.56，-7.55，-7.30，-7.20，-7.18，-7.12（單位kcal/mol）.

表1　對(duì)接構(gòu)象的對(duì)接活性

圖1　鹽酸青藤堿與JAK/STAT信號(hào)通路中JAK1蛋白的對(duì)接構(gòu)象圖

從以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)：對(duì)接能量越低，表示它們的對(duì)接活性越高，抑制能力越強(qiáng).從而選取最優(yōu)構(gòu)想的對(duì)接活性分析，顯示鹽酸青藤堿對(duì)JAK/STAT信號(hào)通路中JAK1蛋白具有一定的抑制能力.

2.2　鹽酸青藤堿對(duì)蘇蕓金桿菌及金葡萄球菌的生長(zhǎng)抑制作用

在涂有細(xì)菌的瓊脂平板上，濾紙片上的待測(cè)試劑會(huì)在瓊脂平板內(nèi)向四周擴(kuò)散，有抑菌活性，就會(huì)在紙片周圍的一定距離的細(xì)菌生長(zhǎng)會(huì)受到影響，在經(jīng)過(guò)24h培養(yǎng)后可以形成一個(gè)抑菌圈，抑菌圈越大，說(shuō)明該藥物抑菌活性越大，反之亦然.按照試驗(yàn)方法，測(cè)得鹽酸青藤堿對(duì)蘇蕓金桿菌和金葡萄球菌的抑菌效果（表2），可見(jiàn)在藥物濃度為5～60mg/mL中對(duì)兩種菌均有抑菌效果，且其對(duì)金葡萄球菌的抑菌效果比蘇蕓金桿菌好.根據(jù)藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)，抑菌圈直徑在20mm以上為極敏，15～20mm為高敏，10～14mm為中敏，10mm以下為低敏，0為不敏.相對(duì)來(lái)說(shuō)，鹽酸青藤堿對(duì)蘇蕓金桿菌的抑菌圈變化不大，在8～10.33mm，為低敏；而鹽酸青藤堿對(duì)金葡萄球菌的抑菌圈變化則較為明顯，在8.33～13.33mm，在40～60ng/mL濃度達(dá)到中敏.

表2　不同藥物濃度的抑菌效果

圖2　不同濃度鹽酸青藤堿對(duì)蘇蕓金桿菌的抑菌效果

圖4　不同濃度鹽酸青藤堿對(duì)金葡萄球菌的抑菌效果

2.3　鹽酸青藤堿不同提取物的抗氧化活性

2.3.1不同提取物對(duì)［DPPH.］自由基清除能力的比較

在515nm處測(cè)得DPPH標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的吸光度值，得到其線性回歸方程為：

Y=0.0215x+0.007，R2=0.9989.表明在0～25μL濃度范圍內(nèi)DPPH濃度與吸光度呈顯著正相關(guān)關(guān)系.

圖4　DPPH標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照公式計(jì)算出不同溶劑提取物對(duì)DPPH自由基的清除率見(jiàn)圖4.在0.1～0.4mg/mL濃度范圍內(nèi)，不同溶劑對(duì)［DPPH.］自由基清除率為：乙醇（95%）＞丙酮＞稀堿，在0.4～1.0mg/mL的濃度范圍內(nèi)，不同溶劑對(duì)［DPPH.］自由基的清除率為：稀堿＞丙酮＞乙醇（95%）.從圖4可以看出，在0.2mg/mL濃度后，稀堿提取物的清除率上升幅度很大，清除率增幅大，說(shuō)明稀堿提取物對(duì)［DPPH.］自由基清除力強(qiáng)，丙酮提取物則較為穩(wěn)定，乙醇提取物在低濃度清除率最好，在較高濃度清除率與丙酮較接近，但都稍弱于稀堿提取物.

根據(jù)以上的相關(guān)數(shù)據(jù)，可作出相關(guān)函數(shù)，由公式算出鹽酸青藤堿不同溶劑提取物的半數(shù)清除濃度和自由基清除率（表2）.結(jié)果顯示半數(shù)抑制濃度和自由基清除力一致，為：稀堿＞丙酮＞乙醇（95%）.稀堿提取物的IC50最小，為0.539mg/mL，VC的IC50則為0.008mg/mL，結(jié)果顯示，鹽酸青藤堿的稀堿，丙酮，乙醇（95%）提取物對(duì)自由基的清除力弱于VC.

圖5　不同溶劑提取物對(duì)［DPPH.］自由基的清除能力

表2　不同溶劑提取物以及VC對(duì)［DPPH.］自由基的清除效果

2.3.2不同提取物對(duì)［ABTS.］自由基清除能力的比較

在低濃度4～10μg/mL的范圍內(nèi)，鹽酸青藤堿的乙醇（95%）提取物和丙酮提取物對(duì)［ABTS.］自由基的清除率變化不大，且丙酮提取物的清除率接近于VC的清除率，乙醇（95%）提取物的清除率在10%左右，丙酮提取物的清除率在25%上下.在10～80μg/mL的濃度梯度中，清除率變化較明顯增幅加大.通過(guò)清除率的對(duì)比可見(jiàn)，VC以及鹽酸青藤堿不同溶劑提取物對(duì)［ABTS.］自由基清除力是VC＞丙酮＞乙醇（95%）（圖6）.

由此作出相關(guān)函數(shù)，由公式算出鹽酸青藤堿不同溶劑提取物的半數(shù)清除濃度和自由基清除率（AE）（表3）.結(jié)果顯示VC，乙醇（95%）提取物和丙酮提取物的IC50分別為：7.60μg/mL，79.89μg/mL，50.55μg/mL.VC，乙醇（95%）提取物和丙酮提取物的自由基清除率分別為：0.1316，0.0125，0.0198.結(jié)果與清除率圖像一致，VC以及鹽酸青藤堿不同溶劑提取物對(duì)［ABTS.］自由基清除力為：VC＞乙醇（95%）＞丙酮.

圖6　不同溶劑提取物以及VC對(duì)［ABTS.］自由基清除率的比較

表3　不同溶劑提取物以及VC對(duì)［ABTS.］自由基的清除效果

3　結(jié)論與討論

多年來(lái)對(duì)JAK-STAT1信號(hào)通路作用機(jī)制及功能已經(jīng)較為清晰，天然藥物化學(xué)作為細(xì)胞外的化學(xué)小分子，與細(xì)胞內(nèi)的受體結(jié)合后引起受體二聚體化，從而使得與受體偶聯(lián)的JAK激酶通過(guò)酪氨酸磷酸化作用而活化.活化的JAK激酶進(jìn)而催化細(xì)胞因子受體的酪氨酸殘基磷酸化并形成STAT1與受體復(fù)合物的結(jié)合的位點(diǎn)［10］，活化的STAT蛋白以二聚體的形式進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與靶基因相結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控靴基因的轉(zhuǎn)錄.

本實(shí)驗(yàn)采用濾紙片法檢測(cè)了鹽酸青藤堿的抑菌效果，表明鹽酸青藤堿對(duì)蘇蕓金桿菌和金葡萄球菌都具有抑菌效果，且對(duì)金葡萄球菌的抑菌活性大于蘇蕓金桿菌.根據(jù)藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)可知，在鹽酸青藤堿濃度為20～60mg/mL濃度范圍內(nèi)，對(duì)蘇蕓金桿菌為低敏；在20～30mg/mL濃度范圍內(nèi)，對(duì)金葡萄球菌為低敏，40～60mg/mL濃度范圍內(nèi)，對(duì)金葡萄球菌為中敏.

通過(guò)DPPH法和ABTS法測(cè)定了鹽酸青藤堿不同溶劑提取物的抗氧化活性，結(jié)果顯示鹽酸青藤堿不同溶劑提取物都具有抗氧化活性.在0.1mg/mL較小濃度就開始對(duì)［DPPH.］自由基有清除能力，在0.1～0.4mg/mL濃度范圍內(nèi)，不同溶劑對(duì)［DPPH.］自由基清除率為：乙醇（95%）＞丙酮＞稀堿，在0.4～1.0mg/mL的濃度范圍內(nèi)，不同溶劑對(duì)［DPPH.］自由基的清除率為：稀堿＞丙酮＞乙醇（95%），表明在較小濃度時(shí)，乙醇對(duì)鹽酸青藤堿的提取較好，在高濃度時(shí)，稀堿對(duì)鹽酸青藤堿的提取較為徹底.三種提取物對(duì)［DPPH.］自由基清除力都弱于VC.由此可見(jiàn)鹽酸青藤堿對(duì)［ABTS.］自由基具有很優(yōu)秀的清除力，在1μg/mL的低濃度時(shí)，也具有一定的清除率.由于1～8μg/mL的濃度變化不大，因此清除率的變化也不大，在10～80μg/mL的濃度梯度里，清除率變化明顯，且丙酮提取物在50.55μg/mL時(shí)就達(dá)到了半數(shù)清除率，且在1～4μg/mL濃度時(shí)，丙酮提取物的清除率接近于VC的清除率，但在較高濃度時(shí)弱于VC.

通過(guò)本研究的結(jié)果可以更為全面的了解鹽酸青藤堿的抗氧化活性和抑菌的活性，可以作為天然抗氧化劑和抑菌劑藥物的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ).以其為進(jìn)一步的抗腫瘤藥物研究奠定堅(jiān)實(shí)理論基礎(chǔ).