馮澤民，萬(wàn)星勇，虞朝輝，厲有名

雷公藤紅素是從雷公藤屬植物根部中提取的一種五環(huán)三萜類(lèi)化合物，具有多種生物學(xué)功能，其抗炎和抗氧化作用可以用來(lái)治療自身免疫性疾病及神經(jīng)退行性疾病[1]。近年來(lái)，雷公藤紅素在脂質(zhì)代謝中的作用受到了越來(lái)越多的關(guān)注。Ma等[2]發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素可以激活熱休克因子1，后者通過(guò)激活過(guò)氧化物酶體激活受體γ共激活劑 -1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α, PGC1A）相關(guān)的代謝程序調(diào)控能量消耗，最終能治療小鼠肥胖及胰島素抵抗。Guan等[3]報(bào)道雷公藤紅素可以通過(guò)激活A(yù)MPK-PGC1A通路，減輕糖尿病大鼠的骨骼肌氧化應(yīng)激。雷公藤紅素是否在非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease, NAFLD）的發(fā)生發(fā)展中起作用尚未明確。本研究旨在通過(guò)軟脂酸（palmitic acid,PA）誘導(dǎo)的NAFLD細(xì)胞模型，研究雷公藤紅素是否能降低HepG2細(xì)胞內(nèi)TG含量，從而進(jìn)一步探究其參與NAFLD發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制。

1　材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；抗體甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH ）、固醇調(diào)節(jié)因子結(jié)合蛋白（sterol-regulatory element-binding protein1c, SREBP-1c）以及脂肪酸合成酶（fatty acid synthase, FAS）購(gòu)于美國(guó)CST公司；PA及雷公藤紅素購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒CCK-8購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；TG測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京普利萊有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HepG2細(xì)胞活度測(cè)定 將細(xì)胞懸液100 μl（約5000個(gè)細(xì)胞）接種至96孔板中，每個(gè)處理水平及對(duì)照均設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。吸盡96孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，PBS洗2遍。每孔加10 μl CCK-8試劑+90 μl DMEM培養(yǎng)基，空白對(duì)照加空白的CCK-8液。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱放置1 h，450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。細(xì)胞活度（%）=[A（加藥）-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）]×100。

1.3.2 PA誘導(dǎo)NAFLD細(xì)胞模型的建立以及雷公藤紅素處理 PA以25%胎牛血清白蛋白懸浮，超聲震蕩至無(wú)顆粒狀懸浮后于37 ℃水浴過(guò)夜，0.22 μm濾頭過(guò)濾后制備成20 mmol/L濃度儲(chǔ)備液于-20 ℃冰箱保存。HepG2細(xì)胞按照2×105/孔的密度鋪于6孔板，24 h后細(xì)胞密度約30%左右，按照PA200 μmol/L（儲(chǔ)備液稀釋100倍）以及指定濃度雷公藤紅素更換培養(yǎng)基，細(xì)胞換液48 h后用于TG測(cè)定以及蛋白、RNA提取。

1.3.3 細(xì)胞內(nèi)TG水平測(cè)定 采用TG測(cè)定試劑盒及分光光度儀，根據(jù)GPO Trinder酶學(xué)反應(yīng)原理檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TG濃度。先將試劑盒中不同濃度TG標(biāo)準(zhǔn)品加入TG工作液，然后用分光光度儀檢測(cè)550 nm處吸光值（OD550）并繪制TG濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。104～105個(gè)靶細(xì)胞中加入100 μl試劑盒中TG裂解液，冰浴10 min，取40 μl裂解液用于蛋白濃度測(cè)定，其余裂解液70 ℃水浴10 min，室溫2000 r/min 離心5 min，取上清加入TG工作液后檢測(cè)OD550值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得TG濃度。檢測(cè)中采用樣本蛋白含量校準(zhǔn)TG含量。

1.3.4 蛋白電泳 用0.05% NaTDC-PBS溶解靶細(xì)胞，12 000 r/min 4 ℃離心15 min，取上清用蛋白定量試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。等量蛋白樣本電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，以兔抗人或鼠SREBP-1c、FAS為一抗，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG為二抗。采用Western blot檢測(cè)目的蛋白雜交條帶，實(shí)驗(yàn)中設(shè)置GAPDH為內(nèi)參。

1.3.5 定量即時(shí)聚合酶鏈鎖反應(yīng) 靶細(xì)胞用0.05%胰酶消化，常規(guī)離心及PBS洗滌后取細(xì)胞沉淀用RNA提取試劑盒提取總RNA，紫外分光光度法測(cè)定總RNA濃度。PGC1A引物序列：上 游 引 物 5′- TCTGAGTCTGTATGGAGTGACAT-3′，下 游 引 物 5′- CCAAGTCGTTCACATCTAGTTCA-3′；過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ （peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ）引物序列：上游引 物 5′- GGGATCAGCTCCGTGGATCT-3′， 下 游 引 物5′- TGCACTTTGGTACTCTTGAAGTT-3′；GAPDH 引物序列：上游引物5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下 游 引 物 5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。然后按反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）和SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa）說(shuō)明書(shū)操作并檢測(cè)各靶基因mRNA，ΔΔCt模型定量分析結(jié)果，實(shí)驗(yàn)中采用GAPDH-mRNA為內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料呈正態(tài)分布，用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，各處理組與對(duì)照組兩兩比較用Dunnett-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1 雷公藤紅素對(duì)HepG2細(xì)胞活度的影響 雷公藤紅素在低濃度（＜800 nmol/L）下對(duì)HepG2細(xì)胞活度無(wú)顯著影響；在800 nmol/L以及1000 nmol/L濃度下細(xì)胞活度略有降低但仍＞80%（88.00%，85.69%）；在2000 nmol/L甚至更高時(shí)細(xì)胞活度顯著降低（圖1）。

圖1 不同濃度雷公藤紅素對(duì)HepG2細(xì)胞活度的影響F=190.900，P=0.000，n=5；*.與雷公藤紅素0 nmol/L組比較，P均＜0.05Figure 1 Different concentrations of celastrol effect on HepG2 cell viability

2.2 雷公藤紅素對(duì)PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞TG水平的影響 根據(jù)雷公藤紅素的細(xì)胞活度實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取5個(gè)不同濃度的雷公藤紅素刺激HepG2細(xì)胞。PA（200 μmol/L）單獨(dú)刺激組較正常對(duì)照組，HepG2細(xì)胞內(nèi)TG水平顯著升高[（69.32±1.79）μg/mg vs.（54.07±2.57）μg/mg]。同時(shí)加用雷公藤紅素可顯著降低細(xì)胞內(nèi)TG水平，其中400 nmol/L組、600 nmol/L組、800 nmol/L組、1000 nmol/L組的TG 水平分別為（64.55±1.92）μg、（64.16±2.19）μg、（60.94±2.70）μg、（61.45±1.61）μg、較 PA 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）（圖2）。

圖2 不同濃度雷公藤紅素對(duì)HepG2細(xì)胞TG水平的影響F=19.570，P=0.001，n=5；*.與雷公藤紅素0 nmol/L組比較，P均＜0.05Figure 2 Different concentrations of celastrol effect on triglyceride levels in HepG2 cells

2.3 雷公藤紅素對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)合成相關(guān)蛋白SREBP1c及FAS表達(dá)的影響 在PA（200 μmol/L）單獨(dú)刺激下，HepG2細(xì)胞的脂質(zhì)合成相關(guān)蛋白SREBP1c及FAS的表達(dá)顯著升高，而同時(shí)以雷公藤紅素600 nmol/L以及1000 nmol/L濃度刺激可下調(diào)此2種蛋白表達(dá)（圖3）。

圖3 雷公藤紅素降低HepG2細(xì)胞脂質(zhì)合成蛋白SREBP1c以及FAS表達(dá)水平Cel.雷公藤紅素Figure 3 Celastrol decreases the expression levels of lipid synthesis proteins, SREBP1c and FAS in HepG2 cells

2.4 雷公藤紅素對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)氧化相關(guān)基因PGC1A及PPARγ表達(dá)的影響 PA（200 μmol/L）單獨(dú)刺激下，HepG2細(xì)胞脂質(zhì)氧化相關(guān)基因PGC1A及PPARγ表達(dá)均下調(diào)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)以雷公藤紅素刺激可升高此2種基因表達(dá)，其中PPARγ表達(dá)水平在600 nmol/L以及1000 nmol/L濃度下分別為1.11±0.09（相較正常對(duì)照組，下同）以及1.16±0.05，與PA組0.86±0.07相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）（圖4）。

3　討　論

NAFLD是指除酒精和其他明確的肝損傷因素以外病因所致、以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征[4]。近年我國(guó)成人NAFLD患病率已約達(dá)到20%，且其發(fā)病率逐年升高[5]。NAFLD發(fā)生發(fā)展機(jī)制目前尚未完全明確，最為公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制為二次打擊學(xué)說(shuō)[6]，其治療也缺乏特別有效的方法。

目前認(rèn)為，雷公藤紅素減輕肥胖及糖尿病的關(guān)鍵分子PGC1A在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。在小鼠肝臟，敲除或抑制PGC1A表達(dá)可導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性、肝臟炎癥及慢性肝臟損傷[7-8]。PGC1A可以通過(guò)上調(diào)過(guò)氧化物酶激活受體 α（peroxisome proliferator-activated receptor α,PPARα）轉(zhuǎn)錄活性，并協(xié)同PPARα增強(qiáng)其下游線粒體脂肪酸β氧化相關(guān)基因肉堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)換酶、極長(zhǎng)鏈?；o酶A脫氫酶，長(zhǎng)鏈酰基輔酶A脫氫酶及?；o酶A的表達(dá)，減輕肝臟脂肪變性[9]。Choi等[10]觀察到雷公藤紅素能有效抑制脂肪細(xì)胞3T3-L1的分化，進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素對(duì)脂肪細(xì)胞脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用與其對(duì)PPARγ表達(dá)抑制相關(guān)。在高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠模型中，厄貝沙坦可以減輕小鼠肝細(xì)胞脂肪變性，而小鼠肝臟 PPARγ表達(dá)上調(diào)，提示增加PPARγ的表達(dá)可以減輕肝臟脂肪變性[11]。有研究指出雷公藤紅素能抑制NF-κB通路及其下游促炎癥因子IL-1β、TNF-α的釋放，減輕糖尿病大鼠的肝臟炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[12-13]。

在本研究中，PA誘導(dǎo)的NAFLD細(xì)胞模型中，雷公藤紅素能顯著降低細(xì)胞內(nèi)TG含量，并呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性?？紤]到只用HepG2 1種肝細(xì)胞株不夠有說(shuō)服力，研究還選取了鼠源性肝細(xì)胞株AML作為研究對(duì)象，但雷公藤紅素?zé)o法降低AML細(xì)胞內(nèi)TG含量（文中未顯示），提示雷公藤紅素降低TG可能存在種屬特異性。進(jìn)一步的機(jī)制探究實(shí)驗(yàn)表明，該作用可能與雷公藤紅素降低HepG2細(xì)胞脂質(zhì)合成蛋白SREBP1c以及FAS表達(dá)水平以及上調(diào)脂質(zhì)氧化相關(guān)基因PPARγ的表達(dá)水平有關(guān)。當(dāng)然，更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臋C(jī)制探索還須要借助于siRNA干擾靶分子及其抑制劑以及激動(dòng)劑來(lái)進(jìn)一步證明。同時(shí)，本研究后續(xù)還應(yīng)納入NAFLD動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)來(lái)更全面論證雷公藤紅素在治療NAFLD中的作用，以期更好地解決這一全球性健康難題。

圖4 雷公藤紅素上調(diào)脂質(zhì)氧化相關(guān)基因PGC1A及PPARγ的表達(dá)水平PGC1A 表達(dá)4組比較，F(xiàn)=2.738，P=0.113，n=3；PPARγ表達(dá)4組比較，F(xiàn)=7.326，P=0.011，n=3；*.與雷公藤紅素0 nmol/L組比較，P均＜0.05Figure 4 Celastrol increases the mRNA levels of lipid oxidation-related genes, PGC1A and PPARγ