陳容娟，劉　妍，李曉東，杜鳳霞，思蘭蘭，李　樂(lè)，許智慧，姚增濤，戴久增，徐東平，段昌柱

核苷（酸）類似物[nucleos(t)ide analogues,NAs]是最主要的抗慢性HBV感染藥物。在我國(guó)，最早上市的拉米夫定（lamivudine, LAM）和阿德福韋酯（adefovir, ADV）仍被臨床廣泛應(yīng)用。其中LAM具有較高的耐藥發(fā)生率（5年耐藥率為70%）[1]，且與ADV無(wú)交叉耐藥位點(diǎn)，因此臨床上積累了大量的LAM耐藥換用ADV單用或聯(lián)用進(jìn)行挽救治療的慢性HBV感染者[2-3]。在長(zhǎng)期LAM或ADV單藥序貫治療下，由于藥物壓力產(chǎn)生耐藥病毒，患者產(chǎn)生同時(shí)耐LAM和ADV的雙重耐藥HBV的幾率增加[4]，繼而發(fā)生病毒學(xué)和/或生化學(xué)突破，不僅加大臨床治療難度，同時(shí)其傳播風(fēng)險(xiǎn)也給公共衛(wèi)生安全帶來(lái)了隱患[5]。目前，臨床上對(duì)HBV感染的LAM/ADV雙重耐藥譜尚缺乏全面的分析。在前期對(duì)我國(guó)患者多重耐藥HBV的研究基礎(chǔ)上[6-7]，本研究通過(guò)對(duì)我國(guó)臨床大樣本來(lái)源的慢性HBV感染者中LAM/ADV雙重耐藥HBV株的檢出率、病毒突變類型及突變病毒株演變和表型耐藥分析，以期為深入了解我國(guó)臨床流行的LAM/ADV雙重耐藥HBV感染特點(diǎn)提供參考，并為L(zhǎng)AM/ADV雙重耐藥HBV感染的防治和挽救治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象與方法 研究對(duì)象為2007年7月—2015年12月在解放軍第三〇二醫(yī)院診治的26 553例慢性HBV感染患者，均接受相關(guān)的NAs治療。診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年更新版）》[8]，HBV DNA定量（2012年4月前臨床檢測(cè)下限為100 IU/ml，4月后為40 IU/ml）、血清生化學(xué)和免疫學(xué)常規(guī)檢查項(xiàng)目由解放軍第三〇二醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心完成。無(wú)其他病毒重疊或混合感染，血清凍存于-20 ℃。

1.2 主要試劑 病毒DNA-OUT提取試劑盒（北京天恩澤公司），pGEM-Teasy載體（美國(guó)Promega公司），pTriEx-HBV（C）1.1倍載體（法國(guó)里昂大學(xué)Zoulim教授惠贈(zèng)），恩替卡韋（entecavir,ETV）（中美上海施貴寶制藥有限公司），ADV（天津葛蘭素史克有限公司），替諾福韋酯（tenofovir,TDF）（美國(guó)吉利德公司）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（上海復(fù)星公司）。引物合成和克隆測(cè)序均由北京天一輝遠(yuǎn)公司完成。

1.3 方法

1.3.1 耐藥突變檢測(cè)分析 26 553例患者的血清樣本均采用本課題組創(chuàng)新建立的超靈敏巢式PCR方法（國(guó)家發(fā)明專利ZL 200910092331.1，檢測(cè)下限為10 IU/ml），進(jìn)行HBV反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase, RT）區(qū)耐藥突變檢測(cè)[9-10]。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA雙向測(cè)序，應(yīng)用DNASTAR Lasergene 7.1、Vector NTI Suite 8 對(duì) rt180、rt181、rt184、rt202、rt204、rt236和rt250等與LAM、ADV或ETV相關(guān)耐藥位點(diǎn)[11]的序列峰圖進(jìn)行分析。采用Mega 4軟件進(jìn)行HBV基因分型。

1.3.2 基因克隆 將PCR產(chǎn)物連接至pGEM-Teasy載體中，每份樣本挑選至少20個(gè)陽(yáng)性克隆測(cè)序并分析耐藥突變。

1.3.3 pTriEx-HBV1.1倍重組質(zhì)粒構(gòu)建 分別提取4種多重耐藥（multidrug-resistant, MDR）質(zhì)粒及其對(duì)應(yīng)的野生型克隆質(zhì)粒，其RT區(qū)片段經(jīng)XhoⅠ和SphⅠ雙酶切后定向克隆至pTriEx-HBV（C）1.1倍表達(dá)載體上，隨機(jī)挑取4個(gè)克隆對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，確定HBV表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

1.3.4 表型耐藥分析 將HepG2細(xì)胞接種于24孔板（1×105個(gè)/孔），18 h后每孔轉(zhuǎn)染0.25 μg質(zhì)粒。5 h后，將細(xì)胞用1×PBS洗2遍，加入在含或不含 NAs（ETV+ADV/TDF/TDF+ETV，ADV、ETV、TDF 的濃度分別為 50、10、200 μmol/L）的 DMEM培養(yǎng)液，隔天換藥。4 d后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)上清的HBV DNA，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用描述性統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行描述，計(jì)算相應(yīng)的頻數(shù)或率。連續(xù)變量呈正態(tài)分布或近似正態(tài)分布，用±s表示。

2　結(jié)　果

2.1 LAM/ADV雙重耐藥株檢出率及基因突變類型 對(duì)26 553例患者血清樣本HBV RT區(qū)PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，LAM/ADV雙重耐藥HBV株的檢出率為0.6%（147/26 553），共檢出12種LAM/ADV雙重耐藥HBV株，其中主要突變類型為rtL180M+A181V+M204V（65.3%）、rtA181V+M204I（10.2%）、rtL180M+A181V+M204V+N236T（5.4%）和rtL180M+M204V+N236T（5.4%）（圖1）。

2.2 LAM/ADV雙重耐藥患者抗HBV用藥信息 147例LAM/ADV雙重耐藥患者臨床抗HBV用藥時(shí)間平均為63（36～151）個(gè)月，用藥方案復(fù)雜多樣，其中有60（40.8%）例患者經(jīng)歷了LAM→ADV單藥序貫或聯(lián)合治療；57（38.8%）例患者經(jīng)歷了LAM→ADV→ETV單藥序貫或聯(lián)合治療；12（8.2%）例患者經(jīng)歷了替比夫定（telbivudine, LdT）→ADV單藥序貫或聯(lián)合治療。

圖1 LAM/ADV雙重耐藥HBV株突變類型Figure 1 Mutational patterns of LAM/ADV dual-drug resistant HBV mutants

2.3 代表性患者LAM/ADV雙重耐藥HBV株的動(dòng)態(tài)演變 患者1應(yīng)用LAM治療24個(gè)月無(wú)法獲得完全病毒學(xué)應(yīng)答，換用LdT與ADV聯(lián)合治療，病毒仍無(wú)法被完全抑制，并在治療5個(gè)月（P1-1）時(shí)病毒突破至1.35×107IU/ml，病毒準(zhǔn)種池中100%為rtA181V突變株；換用LAM與ADV聯(lián)合治療8個(gè)月（P1-2），病毒應(yīng)答不佳，此時(shí)rtA181V突變株占42.11%，rtM204I突變株占5.26%，rtL80I+M204I突變株占42.11%，rtA181V+M204I占10.53%，原方案持續(xù)治療12個(gè)月，病毒仍為無(wú)應(yīng)答狀態(tài)后更換為ETV+ADV聯(lián)合治療，治療12個(gè)月后獲得部分病毒學(xué)應(yīng)答，但在第16個(gè)月（P1-3）時(shí)發(fā)生病毒學(xué)突破，HBV DNA為1.01×103IU/ml，此時(shí)病毒準(zhǔn)種池中rtA181V突變株占31.58%，rtM204I突變株占5.26%，rtL80I+M204I突變株占57.89%，rtA181V+M204I占5.26%；ETV+ADV持續(xù)治療35個(gè)月（P1-4），此時(shí)病毒準(zhǔn)種池中全部為rtA181V突變株；隨后病毒學(xué)發(fā)生部分應(yīng)答，并在治療47個(gè)月后獲得完全病毒學(xué)應(yīng)答（HBV DNA達(dá)到檢測(cè)不到水平），第50個(gè)月（P1-5）時(shí)，病毒準(zhǔn)種池中均為野生型病毒株，直至治療第90個(gè)月，患者都處于完全病毒學(xué)應(yīng)答狀態(tài)（HBV DNA持續(xù)檢測(cè)不到），并在第64個(gè)月（P1-6）和82個(gè)月（P1-7）時(shí)，均未檢出NAs耐藥相關(guān)突變（圖2A）。

患者2應(yīng)用LAM治療應(yīng)答不佳，發(fā)生病毒學(xué)和生化學(xué)突破，HBV DNA為1.41×106IU/ml，ALT為130 U/L，此時(shí)患者更換ADV進(jìn)行挽救治療。在ADV挽救治療12個(gè)月，患者獲得了完全病毒學(xué)應(yīng) 答，HBV DNA＜ 80.00 IU/ml，ALT為 27 U/L。但ADV持續(xù)治療第17個(gè)月（P2-1）時(shí)，再次發(fā)生病毒學(xué)突破，HBV DNA為1.01×104IU/ml，此時(shí)RT區(qū)克隆結(jié)果顯示病毒準(zhǔn)種池中為100% 的rtN236T突變株。更換LdT治療3個(gè)月時(shí)獲得了部分病毒學(xué)應(yīng)答，在LdT持續(xù)治療8～10個(gè)月時(shí)發(fā)生病毒學(xué)突破，并在第10個(gè)月（P2-2）時(shí)，病毒學(xué)突破至3.45×106IU/ml，此時(shí)病毒準(zhǔn)種池全為rtL180M+A181V+M204V突變株；換用ETV治療9個(gè)月無(wú)法獲得完全病毒學(xué)應(yīng)答后加用ADV聯(lián)合治療，在6個(gè)月后獲得完全病毒學(xué)應(yīng)答，并持續(xù)67個(gè)月，HBV都處于完全病毒學(xué)應(yīng)答狀態(tài)，且在ETV+ADV聯(lián)合挽救治療22個(gè)月（P2-3），未檢出NAs耐藥相關(guān)突變；ETV+ADV挽救治療82個(gè)月（P2-4）時(shí)，發(fā)生病毒學(xué)和生化學(xué)突破，HBV DNA 為 2.6×105IU/ml，ALT為 148 U/L，此時(shí)病毒準(zhǔn)種池中rtL180M+M204V突變株占35.00%，rtL180M+S202G+M204V占65.00%；換用TDF治療6個(gè)月后獲得完全病毒學(xué)應(yīng)答（圖2B）。

2.4 代表性LAM/ADV雙重耐藥突變株的復(fù)制力及表型耐藥特點(diǎn)分析 選取4種檢出率最高的LAM/ADV突變株構(gòu)建至HBV 1.1倍基因組長(zhǎng)HBV突變株和相應(yīng)野生株重組復(fù)制子，其復(fù)制力測(cè)定結(jié)果顯示，與相應(yīng)野生株相比，LAM/ADV突變株的復(fù)制力明顯降低。將野生株復(fù)制力設(shè)定為100%，rtA181V+M204I株、rtL180M+A181V+M204V株、rtL180M+M204V+N236T株和rtL180M+A181V+M204V+N236T株的復(fù)制力分別為相應(yīng)野生株的37.5%、44.6%、52.0%和32.8%；體外強(qiáng)效NAs對(duì)4種突變株的抑制結(jié)果顯示：ETV+ADV、TDF和TDF+ETV均可有效抑制野生株復(fù)制，抑制率為98.5%～99.5%。 對(duì)于4種LAM/ADV雙重耐藥突變株，ETV+ADV、TDF和TDF+ETV也展示良好的抑制效果（抑制率分別為80.6%～92.5%、86.1%～97.9%和89.2%～97.5%），相對(duì)而言，TDF和TDF+ETV的抑制效果更好（表1）。

3　討　論

長(zhǎng)期應(yīng)用NAs抗HBV治療是限制或逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)展的關(guān)鍵，但治療過(guò)程中產(chǎn)生病毒耐藥導(dǎo)致治療失敗的問(wèn)題，使得抗HBV治療更加棘手[8，12-13]。耐藥病毒株是由藥物壓力下適應(yīng)性強(qiáng)的突變病毒獲得選擇性擴(kuò)增產(chǎn)生或直接通過(guò)耐藥株的水平傳播產(chǎn)生，且MDR HBV株對(duì)聯(lián)合治療的抗藥性更強(qiáng)[14-15]。對(duì)于LAM耐藥的慢性HBV感染者，指南推薦換用TDF或加用ADV挽救治療。在2014年以前，TDF未在中國(guó)批準(zhǔn)用于抗HBV治療的情況下，LAM耐藥患者均采用加用ADV進(jìn)行挽救治療，且聯(lián)合治療是預(yù)防MDR的有效方式[16]，但有少數(shù)患者仍會(huì)產(chǎn)生MDR[4]。

圖2 2例患者臨床信息和病毒學(xué)演變信息A.患者1血清生化學(xué)及病毒學(xué)演變信息；B.患者2血清生化學(xué)及病毒學(xué)演變信息Figure 2 Clinical information and virologic evolutions of 2 representative patients

表1 LAM/ADV耐藥突變株相對(duì)復(fù)制力及表型分析（±s，%）Table 1 Relative replication capacity and phenotypic characteristics of LAM/ADV resistant HBV strains(±s, %)

表1 LAM/ADV耐藥突變株相對(duì)復(fù)制力及表型分析（±s，%）Table 1 Relative replication capacity and phenotypic characteristics of LAM/ADV resistant HBV strains(±s, %)

突變形式 相對(duì)復(fù)制力 NAs對(duì)HBV DNA的抑制率ETV+ADV TDF TDF+ETV rt野生株 100 99.3 ± 3.2 98.5 ± 2.4 99.5 ± 4.0 rtA181V+M204I 37.5±2.5 83.8 ± 3.7 97.9 ± 1.3 97.1 ± 3.7 rtL180M+A181V+M204V 44.6±2.6 92.5 ± 4.6 97.6 ± 5.6 97.5 ± 4.0 rtL180M+M204V+N236T 52.0±3.2 80.6 ± 1.2 86.1 ± 2.0 89.2 ± 5.0 rtL180M+A181V+M204V+N236T 32.8±3.9 92.2 ± 5.2 96.9 ± 4.0 96.7 ± 5.2

本研究針對(duì)147例LAM/ADV雙重耐藥血清樣本進(jìn)行回顧性分析，其中LAM/ADV雙重耐藥HBV株主要突變類型為rtL180M+A181V+M204V（65.3%）和rtA181V+M204I（10.2%）?；颊吲R床用藥方案顯示，40.8%的患者經(jīng)歷了LAM→ADV單藥序貫或聯(lián)合治療；38.8%的患者經(jīng)歷了LAM→ADV→ETV單藥序貫或聯(lián)合治療。許多患者在LAM耐藥后選擇低耐藥基因屏障藥物ADV或含有共同耐藥譜的ETV進(jìn)行挽救治療情況較為常見，這些都使HBV發(fā)生MDR的風(fēng)險(xiǎn)增大。

對(duì)2例代表性LAM/ADV雙重耐藥患者的抗HBV治療過(guò)程進(jìn)行分析，患者1是在LAM應(yīng)答不佳后采用LdT+ADV挽救治療再換用LAM+ADV后仍應(yīng)答不佳，此時(shí)患者血清病毒準(zhǔn)種池中發(fā)現(xiàn)部分LAM/ADV雙重耐藥株與LAM耐藥株和ADV耐藥株并存。患者2在應(yīng)用LAM應(yīng)答不佳后，換用ADV單藥序貫治療發(fā)生病毒學(xué)突破再換用LdT單藥序貫治療再次發(fā)生病毒學(xué)突破，此時(shí)病毒耐藥檢測(cè)出LAM/ADV雙重耐藥病毒株。NAs應(yīng)答不佳時(shí)再次選用低耐藥基因屏障的NAs藥物進(jìn)行單藥隨意序貫、頻繁換藥或加藥等也增加了MDR發(fā)生的可能性[17]。

在發(fā)生MDR突變時(shí)，指南推薦ETV+TDF或ETV+ADV挽救治療[8]。TDF未在中國(guó)上市前，ETV+ADV是發(fā)生MDR患者的最優(yōu)挽救治療方案。患者1和患者2在發(fā)生雙重耐藥突變后采用ETV+ADV挽救治療，均在3年后獲得完全病毒學(xué)和生化學(xué)應(yīng)答。對(duì)2例LAM/ADV雙重耐藥患者在應(yīng)用ETV+ADV挽救治療后動(dòng)態(tài)血清克隆為雙重耐藥株消失，病毒準(zhǔn)種池中為單一NAs耐藥株或隨著獲得完全病毒學(xué)應(yīng)答時(shí)間的延長(zhǎng)，病毒準(zhǔn)種池中優(yōu)勢(shì)株由單一耐藥株逐漸轉(zhuǎn)換為野生株，最后用本課題組超敏感的巢式PCR擴(kuò)增專利方法也無(wú)法檢測(cè)出RT區(qū)耐藥基因。ETV+ADV是LAM/ADV雙重耐藥慢性HBV感染者的有效挽救治療選擇，但須密切監(jiān)測(cè)肝功能和HBV DNA水平的變化，才能達(dá)到理想的治療效果。

TDF初始治療慢性HBV感染者8年數(shù)據(jù)顯示病毒學(xué)應(yīng)答率良好，并未檢測(cè)到TDF相關(guān)耐藥突變[18]。另外TDF在治療NAs經(jīng)治后發(fā)生單一NAs耐藥或MDR的患者都表現(xiàn)出較高的病毒學(xué)應(yīng)答率，且耐受性良好[19-20]?；颊?在應(yīng)用ETV+ADV挽救治療6年后發(fā)生病毒學(xué)和生化學(xué)突破，此時(shí)病毒準(zhǔn)種池中主要為ETV耐藥株與LAM耐藥株并存，換用TDF治療6個(gè)月后，獲得完全病毒學(xué)應(yīng)答，TDF是ETV+ADV聯(lián)合治療效果應(yīng)答不佳的有效選擇，本研究的體外表型結(jié)果與此相一致。4種LAM/ADV突變株體外表型結(jié)果顯示ETV+ADV、TDF和TDF+ETV均能有效抑制病毒復(fù)制，并且TDF和TDF+ETV的抑制效果更好。

總之，本研究通過(guò)臨床大樣本HBV耐藥分析，首次明確了LAM/ADV雙重耐藥的臨床發(fā)生特點(diǎn)，并對(duì)2例LAM/ADV雙重耐藥典型患者的樣本進(jìn)行了HBV突變株產(chǎn)生特點(diǎn)及耐藥病毒在治療期間的演變進(jìn)行了深入分析，結(jié)果顯示對(duì)于LAM耐藥患者選用低耐藥基因屏障藥物進(jìn)行挽救治療更易發(fā)生MDR從而影響治療效果；ETV+ADV是LAM/ADV MDR患者有效的挽救治療方案，且獲得完全病毒學(xué)應(yīng)答的時(shí)間越長(zhǎng)，越有利于耐藥株為主向野生優(yōu)勢(shì)株為主的轉(zhuǎn)變，從而恢復(fù)對(duì)多種NAs藥物的敏感性；對(duì)于MDR株，選擇高耐藥基因屏障藥物TDF或TDF+ETV挽救治療可以更快的獲得完全病毒學(xué)應(yīng)答，這對(duì)于輔助臨床醫(yī)生在發(fā)現(xiàn)多重耐藥病毒株的HBV患者制定優(yōu)化治療策略具有重要的指導(dǎo)意義。