李小進(jìn)

（山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院，山西太原 030006）

奶牛乳腺疾病[1]主要是乳腺炎[2]，是奶牛的常見(jiàn)病和多發(fā)病[3]，其發(fā)病率達(dá)40%以上，它不僅影響牛奶的質(zhì)量和產(chǎn)量，而且也直接威脅人們的身體健康[4]。

對(duì)于奶牛乳腺及子宮疾病，目前主要是通過(guò)西藥抗生素進(jìn)行治療[5-6]。由于抗生素的使用相當(dāng)頻繁，一方面，大量飲用牛奶，提高了人體素質(zhì)；另一方面，奶農(nóng)為了提高牛奶產(chǎn)量不得不大量使用抗生素對(duì)奶牛進(jìn)行治療和預(yù)防，給人體的健康帶來(lái)新的隱患[7-8]；而牛奶加工企業(yè)為了滿足抗生素指標(biāo)的要求，拒收含有抗生素成分的牛奶，或違規(guī)對(duì)使用過(guò)抗生素的牛奶以低于市場(chǎng)價(jià)40%～50%的價(jià)格進(jìn)行收購(gòu)，不僅給廣大消費(fèi)者帶來(lái)健康風(fēng)險(xiǎn)，也為奶牛養(yǎng)殖者帶來(lái)巨大的損失。

因此，開(kāi)發(fā)新的無(wú)殘留、無(wú)耐藥、無(wú)副作用的純中藥[9-10]——乳疾康，將會(huì)取得良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料 中藥飲片蒲公英、金銀花、連翹均采購(gòu)自山西省絳縣南樊鎮(zhèn)。

1.1.2 試劑與設(shè)備 0.45 μm微孔濾膜、硅藻土、注射用活性炭、甲醇及磷酸（分析純）、色譜級(jí)乙腈均采購(gòu)自山西國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；對(duì)照品咖啡酸、綠原酸均采購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。中藥提取設(shè)備、旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)器、烘箱、紫外分光光度計(jì)、高效液相色譜儀等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 處方選擇 根據(jù)發(fā)病機(jī)理查閱了大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，復(fù)方蒲公英注射液治療動(dòng)物乳腺炎具有明顯的療效[11-12]。蒲公英具有散結(jié)化淤，抗菌消炎之功效[13-14]，自古就是治療人體乳腺炎的良藥[15]；金銀花具有清熱解毒，抗菌消炎之功效[16]，能有效提高蒲公英治療效果；連翹具有清熱解毒，抗菌消炎之功效[16]，能有效提高蒲公英、金銀花抗菌消炎之功效。根據(jù)現(xiàn)有中藥注射劑中藥成分不宜過(guò)多等原則，選取蒲公英、金銀花、連翹3味藥[17]作為本項(xiàng)目研究處方。通過(guò)與多位臨床獸醫(yī)研究確定，其基本處方為：蒲公英 10 g，金銀花 5 g，連翹 5 g。

1.2.2 蒲公英含量測(cè)定方法 用HPLC法測(cè)定蒲公英以及乳疾康注射液中咖啡酸與綠原酸含量[18-19]。

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密配制每毫升含咖啡酸 40 μg、綠原酸 20 μg（混合）的甲醇溶液，作為HPLC法測(cè)定樣品中咖啡酸和綠原酸含量用的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 取含有100 μg/mL咖啡酸和50 μg/mL綠原酸的甲醇混合溶液，置紫外分光光度儀上進(jìn)行掃描，根據(jù)掃描結(jié)果，選擇最大吸收波長(zhǎng)作為標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.2.2.3 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以磷酸（含0.1%磷酸的水溶液）與乙腈的體積比（85∶15）為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)322 nm，各化合物之間分離度符合要求。

1.2.3 提取方法選擇 蒲公英作為本研究處方的主藥，首先對(duì)其提取工藝[20-21]進(jìn)行了研究。取蒲公英1 000 g，于60℃烘烤6 h，恒質(zhì)量得樣品930 g，粉碎過(guò)0.59 mm篩，作為原藥材樣品。取樣品20 g共3份，分別采用水加熱回流、超聲提取和甲醇加熱回流進(jìn)行提取，各3批次，測(cè)定提取固體含量，能夠有效避免目前尚不清楚有效成分的遺漏，因此，選取固體含量最高者作為本提取方法考量條件之一。

1.2.4 乳疾康注射液制備工藝

1.2.4.1 考察提取液有無(wú)異?，F(xiàn)象 分別取蒲公英（粉碎過(guò)0.25 mm篩）10 g，金銀花5 g，連翹（粉碎過(guò)0.25 mm篩）5 g，加自來(lái)水50 mL浸泡30 min，加熱回流30 min，趁熱過(guò)濾，濾渣加水30 mL，加熱回流20 min，過(guò)濾，合并濾液，濃縮到15 mL，冷卻過(guò)濾，合并3種濾液，加熱回流30 min，觀察有無(wú)沉淀、渾濁、氣體釋放等現(xiàn)象。

1.2.4.2 單味藥分別提取考察 蒲公英：取蒲公英600 g，粉碎過(guò)0.25 mm篩，分成12份，每份50 g，分4組標(biāo)注，每組3批。分別用自來(lái)水浸泡30 min，第1組，各加水200 mL，加熱回流45 min，趁熱過(guò)濾，濾渣加水100 mL，回流30 min，合并濾液，減壓濃縮，100℃烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量。第2組，各加水300 mL，加熱回流 45 min，趁熱過(guò)濾，濾渣加水150 mL，回流 30 min，合并濾液，減壓濃縮，100 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量。第3組，各加水500 mL，加熱回流45 min，趁熱過(guò)濾，濾渣加水200 mL，回流30 min，合并濾液，減壓濃縮，100℃烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量。第4組，各加水200mL，在45℃超聲45min，過(guò)濾，濾渣加水100 mL，在45℃超聲30 min，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮，100℃烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量。金銀花和連翹各取600 g，分別按蒲公英單味提取所述方法操作。

1.2.4.3 處方藥混合提取考察 分別取粉碎并過(guò)0.25 mm篩的蒲公英800 g、金銀花400 g、連翹400 g，蒲公英、金銀花、連翹以2∶1∶1的比例混合均勻，分成12分，每份100 g（多余部分棄去），按照蒲公英單味提取所述方法操作。

1.2.4.4 注射劑小試樣品提取及制作工藝 中間體制備：取中藥材蒲公英500 g，金銀花250 g，連翹250 g，粉碎混合，加水3 000 mL浸泡30 min，再加水3 000 mL，煮沸45 min，過(guò)濾；濾渣加水3 000 mL，煮沸30min，過(guò)濾；合并濾液，減壓濃縮至約500mL，加硅藻土500 g，旋轉(zhuǎn)減壓干燥，轉(zhuǎn)移至烘箱中，100℃烘干至恒質(zhì)量，冷卻包裝保存，性狀為深黃色粉末，無(wú)結(jié)塊，易干燥。

小試樣的制備：取本品38.8 g，加注射用水100 mL，在45℃超聲提取30 min，過(guò)濾，濾渣加注射用水50 mL，在45℃超聲提取30 min，過(guò)濾，合并濾液，濃縮至35 mL，在4℃條件下，放置24 h，過(guò)濾，濾液加注射用水至100 mL，加注射用活性炭0.02 g，于60℃保溫30 min，過(guò)濾、精濾，分裝于10 mL西林瓶中，于105℃滅菌30 min，制成每瓶含2.5 g蒲公英（按蒲公英質(zhì)量計(jì)算）注射劑樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒲公英含量測(cè)定

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 根據(jù)掃描結(jié)果，測(cè)試溶液在322 nm處有最大吸收，因此，選擇波長(zhǎng)322 nm作為標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.2 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 對(duì)乳疾康注射液進(jìn)行HPLC分離，在波長(zhǎng)322 nm處檢測(cè)，各化合物之間分離度符合要求，結(jié)果如圖1所示。

2.1.3 蒲公英中咖啡酸與綠原酸含量測(cè)定結(jié)果精密量取蒲公英粉末2g,共3份，分別加純水50mL，稱質(zhì)量，浸泡1.5 h[22]。加熱回流1.5 h，冷卻至室溫。加純水補(bǔ)足質(zhì)量，再加無(wú)水甲醇50 mL，搖勻，用0.45 μL微孔濾膜過(guò)濾，得供試品溶液，分別測(cè)定咖啡酸與綠原酸含量，結(jié)果如表1所示。

表1 蒲公英中咖啡酸與綠原酸含量測(cè)定結(jié)果 %

2.2 提取方法及工藝考察

2.2.1 考察提取液有無(wú)異?，F(xiàn)象 對(duì)蒲公英、金銀花、連翹（分別粉碎過(guò)0.25 mm篩）單味藥和混合物分別采用加水浸泡、加熱回流的方法進(jìn)行提取，結(jié)果顯示，均無(wú)沉淀、渾濁、氣體釋放等現(xiàn)象，說(shuō)明本方法可行。

2.2.2 單味藥提取方法考察 蒲公英、金銀花、連翹各取600 g，每味藥分為12份，分4組進(jìn)行提??；取3種藥混合均勻后按單味藥分組的方法進(jìn)行提?。糠莺压?0 g，含金銀花和連翹各25 g），提取結(jié)果分別如表2～5所示。

表2 蒲公英提取物干質(zhì)量和指標(biāo)性成分測(cè)定結(jié)果

表3 金銀花提取物干質(zhì)量和指標(biāo)性成分測(cè)定結(jié)果

表4 連翹提取物干質(zhì)量和指標(biāo)性成分測(cè)定結(jié)果

表5 混合提取物干質(zhì)量和指標(biāo)性成分測(cè)定結(jié)果

從表2～5可以看出，混合提取的第3組樣品提取物及指標(biāo)成分（咖啡酸和綠原酸）含量最多，因此，其可作為提取的最佳工藝，即將3味藥混合加水500 mL，加熱回流45 min，趁熱過(guò)濾，濾渣加水200 mL，回流30 min，合并濾液，減壓濃縮至規(guī)定體積（進(jìn)一步制作注射液所需要的體積）。

從上述試驗(yàn)可以看出，對(duì)注射液及原料的咖啡酸和綠原酸進(jìn)行含量測(cè)定，采用高效液相色譜法，檢測(cè)方法為紫外分光光度法，在322 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)含量，處方中的藥材提取，是以加水回流提取混合藥材為最佳方法；利用處方提取液制備注射液，并使用硅藻土進(jìn)行處理制備得到澄明合格的乳疾康注射液（質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定另行研究）。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，各味中藥提取液無(wú)沉淀、渾濁、氣體釋放現(xiàn)象，說(shuō)明在制作工藝是可行的。通過(guò)不同提取工藝結(jié)果對(duì)比分析，各味中藥單藥提取后混合與混合提取有明顯的差別，混合提取效果明顯優(yōu)于單味藥提取，說(shuō)明中藥提取方法很重要，不同的提取方法可能會(huì)得到不同的結(jié)果和療效。分析原因，可能是由于不同藥材含有不同的酸堿性物質(zhì)，在提取過(guò)程中生成鹽類物質(zhì)，同時(shí)，含有大量相同或相類似物質(zhì)，產(chǎn)生同離子效應(yīng)，從而提高提取率。

通過(guò)注射劑制備工藝（采用加水回流提取，利用硅藻土處理提取液的制備工藝）研究，改變了現(xiàn)有的水煮酒沉的方法，取得了較好的效果。

由于中藥復(fù)方的復(fù)雜性，提取物質(zhì)量作為優(yōu)選提取方法的主要依據(jù)，高效液相色譜法含量測(cè)定僅可以作為優(yōu)選提取方法的參考依據(jù)，但為制定乳疾康注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)打下良好的基礎(chǔ)。