阮思蓓 黃 娟 唐曉琴 李 昕 羅斯譯 唐亞平 凌 鳳 唐 紅 唐明希▲

1.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院病理科，四川瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學神經(jīng)生物學研究所，四川瀘州 646000

阿爾茨海默?。╝lzheimer’s disease，AD）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性病變，最初表現(xiàn)為患者記憶力減退，進而發(fā)展為進行性的認知功能障礙和神經(jīng)行為異常[1]，特征性病理改變?yōu)槟X組織中β淀粉樣蛋白沉積和tau蛋白的過度磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)，以及神經(jīng)元丟失伴膠質(zhì)細胞增生，然而其病因和發(fā)病機制卻尚未明確[2-3]。研究表明表觀遺傳修飾與AD的發(fā)病相關(guān)[2，4-5]，作為表觀遺傳中最常見的類型，DNA甲基化修飾也越來越得到科學研究者的關(guān)注，本文通過簡化表觀亞硫酸氫鹽測序技術(shù)（reduced representation bisulfite sequencing，RRBS）初步檢測中期AD PS1/PS2 dKO mice 動物模型海馬組織中DNA甲基化改變圖譜，初步探討與AD相關(guān)的甲基化修飾基因。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

親代dKO小鼠（遺傳背景為B6CBAF1，基因型為 Cre+/-， fPS1/fPS1， PS2-/-）由美國 Ya-PingTang教 授（Louisiana State University，USA）惠贈，小鼠造模、模型特點以及繁殖飼養(yǎng)和基因型鑒定如前期報道[6-7]

表2 Hnf4a基因甲基化狀態(tài)

1.2 海馬組織分離及其DNA提取

1.2.1 海馬組織分離 （1）采用斷頸法處死小鼠；（2）用粗剪剪開并分離小鼠腦部皮毛，完全暴露頭骨；（3）換組織剪沿小鼠顱骨矢狀線將頭骨剪開暴露腦組織；（4）用眼科剪迅速分離出海馬組織放入標記好的凍存管后，置于液氮罐中速凍；（5）30min以內(nèi)將海馬組織轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存。

1.2.2 海馬組織DNA提取 （1）使用TIANamp DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，貨號：DP304），按照試劑盒操作說明書提取分離海馬組織的基因組DNA；（2）分離的DNA進行DNA純度和濃度鑒定后-20℃保存待檢。

1.3 RRBS測序檢測基因組甲基化狀態(tài)

分離的DNA純化后進行甲基化譜RRBS測序（杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司，測序儀Illumina HiSeq 2500），RRBS測序原理及文庫構(gòu)建方法如Brant JO[8]所述。測序完成后使用NGSQCToolkit_v2.3軟件做質(zhì)量控制，Bismark（vO.7.4）進行小鼠參考基因的比對，edgeR軟件分析篩選出異常甲基化基因，篩選標注為P＜0.05。

1.4 統(tǒng)計學方法

實驗組和對照組間基因甲基化測序結(jié)果使用卡方檢驗，統(tǒng)計學軟件使用SPSS13.0版，結(jié)合生物公司edgeR軟件分析，最終得到FC值，表示實驗組與對照組間樣本發(fā)生甲基化個數(shù)的比值，以P＜0.05為兩組間基因甲基化差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠海馬組織基因組DNA 質(zhì)量鑒定

紫外分光光度儀檢測小鼠海馬組織基因組DNA質(zhì)量結(jié)果見表1，DNA A260/A280范圍為1.97 ～ 2.04，DNA濃度集中在100 ～ 140ng/μL。另1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示電泳條帶清晰完整，無明顯彌散或拖尾（見圖1）。DNA質(zhì)量鑒定滿足RRBS甲基化測序要求。

表1 小鼠海馬組織基因組DNA 質(zhì)量鑒定結(jié)果

圖1 小鼠海馬組織DNA樣本1%瓊脂糖電泳圖（M：DNA Marker；T：dKO mice； C：Control

2.2 Hnf4a基因甲基化篩選結(jié)果

通過實驗組與對照組RRBS的測序結(jié)果，Bismark（vO.7.4）生物軟件將過濾后的高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)利用edgeR軟件與小鼠參考基因進行甲基化差異性比對，篩選出位于2號染色體上，起始位點為163546988，終止位點為163547688的啟動子基因Hnf4a表現(xiàn)出高甲基化狀態(tài)（FC值=4.499，P=0.0283，P＜ 0.05）。見表 2。

3 討論

Presenilin-1（PS1）基因與 Presenilin-2（PS2）基因是早發(fā)性AD發(fā)病的機制之一，研究表明本實驗運用的PS1/PS2 dKO mice模型具有同AD一樣的呈年齡依賴性的神經(jīng)退行性病變的特點，6月齡開始表現(xiàn)出輕度的神經(jīng)退行性疾病表現(xiàn)，12月齡時出現(xiàn)中度認知功能障礙、定向障礙、腦室擴大、神經(jīng)元細胞變性壞死等神經(jīng)癡呆表現(xiàn)[2，6，9]。本文通過飼養(yǎng)、傳代PS1/PS2 dKO mice動物，進行基因型鑒定后，利用RRBS甲基化測序技術(shù)檢測其中期（12月齡）海馬組織中基因組甲基化狀態(tài)的改變，與同系同月齡對照組小鼠比較后篩選出一個呈高甲基化狀態(tài)的Hnf4a基因。

Hnf4a基因編碼的蛋白質(zhì)，即肝細胞核因子4a（hepatocyte nuclear factor 4 alpha，HNF4A），是 以同源二聚體形式結(jié)合DNA的核轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控脂肪代謝、糖異生及膽固醇代謝等方便起著重要作用。能夠調(diào)控脂肪酸氧化、促進膽汁酸分泌等。研究表明Hnf4a基因與肝細胞癌、非酒精性脂肪肝、病毒性肝炎等多種肝臟疾病相關(guān)，HNF4a低表達的肝細胞癌患者生存期顯著低于高表達者[10-13]，此外Hnf4a基因多態(tài)性與Ⅱ型糖尿病發(fā)生胰島素易感風險相關(guān)[14]。關(guān)于Hnf4a基因在阿爾茨海默病方面的研究，Liu等[15]報道組蛋白脫乙酰酶2（Histone deacetylase 2， HDAC2）過表達后引起HNF4A轉(zhuǎn)錄因子脫乙?；瑥亩ㄟ^HDAC2/HNF-4A/miR-101b/AMPK信號通路誘導小鼠模型中tau蛋白過度磷酸化和聚集，而這正是AD典型的病理變化之一。但目前尚未報道該基因甲基化改變在AD發(fā)病機制中的作用，本文用RRBS甲基化測序法提示HNF4A基因在中期阿爾茨海默病小鼠模型海馬組織中呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，初步提示高甲基化的HNF4A基因可能在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著一定的作用，但由于AD的發(fā)生與多種因素相關(guān)，而本文目前僅限于RRBS測序結(jié)果，我們后續(xù)需要增加樣本量，并進一步采用單基因甲基化測序、甲基化特異性PCR、免疫組織化學及免疫印跡法等實驗學方法分析驗證該基因的甲基化狀態(tài)以及轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的影響，并結(jié)合早期和晚期AD動物模型海馬組織中該基因甲基化改變，更加全面的了解Hnf4a基因的甲基化狀態(tài)在AD疾病中的動態(tài)變化。

綜上所述，Hnf4a基因在中期AD小鼠模型海馬組織中呈高甲基化狀態(tài)，可能參與到中度神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的病程變化中，為后續(xù)驗證、篩選、動態(tài)研究Hnf4a基因在AD不同病程中的變化提供了基礎(chǔ)資料以及針對Hnf4a基因靶向診斷、治療、預(yù)后提供了理論依據(jù)。