張 昊 張 毅 程博聞 王攀磊 田 云

(天津工業(yè)大學(xué)紡織學(xué)院1，天津 300387) (天津工業(yè)大學(xué)；改性與功能纖維天津市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，天津 300387)

環(huán)糊精(cyclodextrin，簡稱CD)是由環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶催化淀粉或其相關(guān)的物質(zhì)所得到的環(huán)狀化合物，最常見的有α-CD、β-CD、γ-CD 3種, 分別由6、7、8 個(gè)葡萄糖殘基通過α-1, 4 糖苷鍵連接而成。環(huán)糊精外親水、環(huán)內(nèi)疏水的性質(zhì)使其能與各種有機(jī)物作用形成穩(wěn)定的復(fù)合物，改變有機(jī)物的某些性質(zhì)，從而在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、化工等領(lǐng)域都具有廣泛的用途[1-6]。在這3種環(huán)糊精中，γ-環(huán)糊精內(nèi)腔最大，具有更廣泛的包埋客體分子的能力，并且其較高的水溶性、突出的乳化特性和安全性，使其在食品、制藥和化妝品等領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用空間[7-9]。故建立一種簡便快速測定產(chǎn)品含量的方法，對實(shí)現(xiàn)γ-環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用具有重要意義。

目前CD的測定方法有熒光分析法、旋光度法、還原糖測定法以及高效液相色譜法等，各有優(yōu)缺點(diǎn)。熒光分析法是分析目前生物大分子的常用分析手段之一，但由于包括環(huán)糊精在內(nèi)的多糖類物質(zhì)本身并無熒光基團(tuán)，故需要采用昂貴的衍生化試劑對環(huán)糊精進(jìn)行熒光化，測定成本較高，步驟煩瑣，且重復(fù)性較低[10-11]。比旋光度法主要采用一些自身無旋光性的物質(zhì)作為探劑，利用其與環(huán)糊精形成包絡(luò)后引起后者旋光度變化值來間接測定環(huán)糊精含量，該方法測試靈敏較低，且由于環(huán)糊精的高旋光性，除探劑之外的其他因素如pH、溫度、甚至環(huán)糊精濃度等均可引起旋光度的變化，測定結(jié)果不穩(wěn)定，易受干擾，只能作為一種輔助分析手段[12]。還原糖法同樣是多糖及寡糖類的常用定量方法，其原理是通過將樣品酶解后測定酶解液中還原糖含量來對樣品定量。其優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)靈敏，線性關(guān)系良好，缺點(diǎn)是缺少專一性，由于所有糖類物質(zhì)對此方法均有相應(yīng)，故如樣品中含有的葡萄糖及淀粉等成分會影響測定結(jié)果[13]。高效液相色譜(HPLC)法結(jié)果準(zhǔn)確，精度高，且專一性強(qiáng)，但需要昂貴的色譜儀，對實(shí)驗(yàn)人員的要求也較高，且用時(shí)較長，難以廣泛使用[14-16]。相比較而言，分光光度法具有儀器簡單，操作容易，測定快速等優(yōu)點(diǎn)，且在一定條件下其測定結(jié)果與HPLC法相近，故較適于CD的一般生產(chǎn)和使用單位采用[17-18]。

有關(guān)γ-CD 的分光光度法測定，國內(nèi)外報(bào)道較少，僅Kato等[19]及劉虹等[20]有過研究。Tako首先以溴甲酚綠(BCG)為指示劑，利用BCG與γ-CD形成包絡(luò)物后增色的原理，建立了γ-CD 的分光光度測定方法。國內(nèi)的劉虹等在此基礎(chǔ)上通過優(yōu)化工藝，對該法進(jìn)行了完善。但以BCG為指示劑的γ-CD測定方法尚存在不足。首先，BCG對γ-CD的增色機(jī)理尚不明確；其次，受BCG指示劑變色范圍的影響，此法需在酸性環(huán)境中測定，由于環(huán)糊精不耐酸的特性，在酸性中極易分解，從而影響了此法測定結(jié)果的準(zhǔn)確性[21]。

由此可見，在γ-CD的分光光度測定中，探劑的選擇尤為重要。本文首次發(fā)現(xiàn)γ-CD 與鄰甲酚酞分子包絡(luò)后會顯著降低后者的吸光值，即γ-CD對鄰甲酚酞溶液具有顯著的褪色效應(yīng)。且其吸光度減小值與γ-CD濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，符合朗伯—比爾定律。此外，與溴甲酚綠不同的是，由于鄰甲酚酞探劑分子與γ-CD包絡(luò)并褪色的pH條件為弱堿性(pH=9～10)，而在此條件下環(huán)糊精結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，故而在最大程度上避免了因樣品的分解對測定結(jié)果的影響，使測定的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性方面得到必要的保障?；诖?，本研究建立了以鄰甲酚酞為指示劑的γ-CD含量分光光度測定方法，同時(shí)就各參數(shù)對測定的影響進(jìn)行了討論，優(yōu)化了測定方法，并對測定結(jié)果的準(zhǔn)確性、重復(fù)性進(jìn)行了深入分析。

1 材料與方法

1.1 主要材料

γ-環(huán)糊精(γ-CD)：德國瓦克化學(xué)試劑有限公司，分析純；鄰甲酚酞(OCP)：上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

島津2600紫外可見光分光光度計(jì)：日本島津公司：Waters 1525高效液相色譜儀：美國沃特世公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶液的配制

鄰甲酚酞溶液：以90%乙醇溶液配制4.2 mmol/L OCP母液，使用時(shí)再以20%乙醇溶液稀釋配制成所需濃度溶液；pH=9.51碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖溶液：由0.1 mol/L碳酸鈉與0.1 mol/L碳酸氫鈉溶液配制并以酸度計(jì)校準(zhǔn)；γ-CD標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量γ-CD，以去離子水配制成25 mmol/L的γ-CD標(biāo)準(zhǔn)儲備液100 mL。使用時(shí)，再以去離子水稀釋制成所需濃度的γ-CD待測樣品溶液。

1.3.2 γ-CD的分光光度測定方法

吸光度差值△A的測定：取一定濃度OCP溶液3 mL 加入比色管中，隨后加入一定濃度的γ-CD溶液3 mL，以pH=9.51碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖溶液定容至25 mL并混勻。于30℃恒溫水浴中靜置15 min后，在567 nm處以緩沖溶液為參比測定其吸光度。在空白實(shí)驗(yàn)中，以3 mL蒸餾水替代γ-CD溶液，其余實(shí)驗(yàn)操作相同。

吸光度差值(△A)=空白溶液吸光度(A′)-樣品溶液吸光度(A)

γ-CD標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取一定濃度的OCP溶液3 mL分別加入數(shù)個(gè)比色管中，隨后依次在各管中加入濃度為1.5、3、4.5、6、7.5、9 mmol/L的γ-CD溶液3 mL，以pH=9.51碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖溶液將各管定容至25 mL并混勻。于30 ℃恒溫水浴中靜置15 min后，在567 nm處以緩沖溶液為參比測定其吸光度。在空白實(shí)驗(yàn)中，以3 mL蒸餾水替代γ-CD溶液，其余實(shí)驗(yàn)操作相同。以γ-CD濃度為橫坐標(biāo)，被測樣品溶液與空白溶液吸光度差△A為縱坐標(biāo)作圖，得到一正相關(guān)曲線，作為 γ-CD 標(biāo)準(zhǔn)曲線。

此方法的檢出限采用式(1)計(jì)算[22]：

(1)

式中：DL為檢出限/mmol/L；K′為根據(jù)一定置信水平確定的系數(shù)，IUPAC建議取3；Sh為空白多次測得信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差(至少20次)；k為方法的靈敏度, 即標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

計(jì)算此方法中OCP-(γ-CD)包絡(luò)物的摩爾吸光系數(shù)采用式(2)計(jì)算[23]：

(2)

1.3.3 γ-CD的HPLC測定方法

準(zhǔn)確稱取一定量γ-CD與去離子水配制成10 mmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，隨后以去離子水分別稀釋成5、4、3、2、1、0.5 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別以50 μL的進(jìn)樣量注入Waters 1525高效液相色譜儀，根據(jù)峰面積和濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。色譜條件為：色譜柱：Aqueous Column 2.5 μm 150×4.6 mm；流動相：甲醇：水(5∶95)；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：50μL；柱溫：40 ℃。隨后配制濃度為4.5 mmol/L的γ-CD待測樣品溶液，以相同的色譜條件進(jìn)行含量測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 鄰甲酚酞褪色原理

鄰甲酚酞(簡稱OCP)又稱鄰甲苯酚酞，與酚酞具有相近的化學(xué)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)，其變色范圍為8.2～9.8，其酸式結(jié)構(gòu)為無色的內(nèi)酯形式，堿式結(jié)構(gòu)為醌式而顯紅色。γ-CD使OCP褪色的原理可如圖1所示。當(dāng)OCP分子處于變色pH范圍內(nèi)時(shí)，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，容易發(fā)生重排，在與γ-CD形成包絡(luò)物后，部分OCP中心碳原子由原來的sp2雜化轉(zhuǎn)化為以sp3雜化軌道成鍵，其結(jié)構(gòu)發(fā)生了由醌式向內(nèi)酯形式的轉(zhuǎn)變，從而阻礙了三苯環(huán)共軛體系的形成，并使OCP溶液褪色[24]。

圖1 OCP與γ-CD形成包絡(luò)物褪色的原理示意

2.2 γ-CD與OCP包絡(luò)物的光譜分析

由圖2可知，OCP在堿性條件下最大吸收波長為567 nm，在與γ-CD形成包絡(luò)物后，OCP-(γ-CD)譜峰形狀與OCP類似，而在最大吸收波長處則出現(xiàn)顯著減色效應(yīng)。由圖2中還可發(fā)現(xiàn)，在567 nm下OCP-(γ-CD)的減色程度隨γ-CD含量的增加而增大，即在一定范圍內(nèi)，此吸光度差值ΔA與γ-CD濃度呈線性關(guān)系，符合朗伯—比爾定律。這也是本文基于鄰甲酚酞褪色法的γ-CD含量分光光度測定的理論依據(jù)[25]。

圖2 OCP及不同濃度γ-CD與OCP形成包絡(luò)物的吸收光譜

2.3 顯色時(shí)間的確定

OCP-(γ-CD)體系達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)需要一段時(shí)間，期間樣品的吸光度會隨時(shí)間的增加而減小，即發(fā)生褪色效應(yīng)。以一定時(shí)間為間隔測定其吸光度，并以被測樣品溶液與空白溶液吸光度差ΔA對顯色時(shí)間作圖，結(jié)果如圖3所示。可知，在前5 min OCP-(γ-CD)形成速度較快，吸光度降低較大，褪色效應(yīng)明顯。其后形成速率變得緩慢，吸光度降低程度也隨之減小。顯色15 min 后，吸光度達(dá)到穩(wěn)定，并在其后10 min內(nèi)基本保持不變。本文選擇γ-CD與OCP混合靜置15 min后測定其吸光度。

圖3 OCP-(γ-CD)形成速率及穩(wěn)定性

2.4 測定條件對γ-CD測定的影響

2.4.1 pH對γ-CD測定的影響

加入不同pH值的碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液使體系呈不同pH, 按1.3.2小節(jié)中實(shí)驗(yàn)的方法測定其吸光度, 并以ΔA對γ-CD濃度作圖，結(jié)果如圖4所示。

起初隨pH增大測定曲線斜率隨之增大，即靈敏度升高。當(dāng)pH=9.51時(shí)，斜率達(dá)到最大值，超過此pH斜率又有所下降。由2.1中原理分析可知，當(dāng)OCP分子處于變色范圍內(nèi)時(shí)，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，部分OCP分子在與γ-CD形成包絡(luò)后分子發(fā)生重排，共軛結(jié)構(gòu)遭到破壞，使溶液出現(xiàn)減色效應(yīng)。故本法γ-CD含量的測定需要適宜的堿性環(huán)境。但當(dāng)體系堿性過高時(shí)，這種由醌式向內(nèi)酯式的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變可能較難發(fā)生，使褪色現(xiàn)象減弱[26]。由此可知，以O(shè)CP為探劑的γ-CD分光光度測定時(shí)，其緩沖體系pH應(yīng)處于OCP分子的變色范圍內(nèi)，但不宜過高，在本文建立的方法中以pH=9.51為宜。

圖4 pH對γ-CD測定的影響

2.4.2 溫度對γ-CD測定的影響

由圖5可知，在30 ℃以下，隨著溫度的升高，測定曲線的斜率逐漸增大，即靈敏度提高，說明γ-CD與OCP分子形成復(fù)合物的驅(qū)動力大小受溫度的一定影響。適當(dāng)提高溫度可使OCP-(γ-CD)包絡(luò)物的穩(wěn)定性增加，使減色效應(yīng)增強(qiáng)，提高了檢測的靈敏度。但當(dāng)溫度超過30℃后，曲線斜率又有下降趨勢，且相關(guān)系數(shù)R2值較小，說明標(biāo)曲線性關(guān)系下降?？赡苁怯捎跍囟冗^高時(shí)不利于OCP-(γ-CD)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，不僅會影響檢測的靈敏度，也容易引起數(shù)據(jù)波動，影響檢測的準(zhǔn)確性。故在本文中γ-CD含量的測定溫度以30 ℃為宜。

圖5 溫度對γ-CD測定的影響

2.4.3 OCP濃度對γ-CD測定的影響

加入3 mL不同濃度的OCP溶液，測定其吸光度，并以ΔA對γ-CD濃度作圖, 結(jié)果如圖6所示。可以看出，OCP 濃度對測定ΔA與γ-CD濃度之間的線性關(guān)系影響不大，但影響測定的靈敏度。標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率隨OCP濃度的提高逐漸增大，但當(dāng)OCP濃度大于0.21 mmol/L后，曲線斜率雖然繼續(xù)增加，但此時(shí)測試樣品的吸光值已大于1，超出朗伯—比爾定律的最佳測定濃度范圍，故綜合考慮測試方法的靈敏性及測試結(jié)果的可靠性，本文選擇探劑OCP濃度為0.21 mmol/L。

圖6 OCP濃度對γ-CD測定的影響

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

在選定的測定條件下，按實(shí)驗(yàn)方法測定其吸光度，并以ΔA對γ-CD濃度作圖，結(jié)果如圖7所示。當(dāng)測定γ-CD 的濃度范圍為0～15 mmol/L時(shí)，R2為0.997 5；但當(dāng)其濃度測定范圍擴(kuò)大為0～21 mmol/L時(shí)，R2降低為0.971 2。試驗(yàn)確定γ-CD的線性測定范圍為0～15 mmol/L。校準(zhǔn)曲線方程ΔA=0.032 5cγ-CD(mmol/L)，R2為0.997 5。檢出限為0.066 mmol/L，表觀摩爾吸光系數(shù)ε=3.06×103Lmol-1cm-1。

圖7 γ-CD測定線性范圍的確定

2.6 γ-CD測定的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)與標(biāo)準(zhǔn)加入回收實(shí)驗(yàn)[28]

配制25 mmol/L的γ-CD標(biāo)準(zhǔn)儲備液100 mL，從中取5 mL稀釋至一定體積，按1.3.2中的實(shí)驗(yàn)方法測定γ-CD含量，平行測定10 次，作為γ-CD測定的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。再各取5份25 mmol/L 的γ-CD標(biāo)準(zhǔn)儲備液5 mL加入不同試管，隨后繼續(xù)加入不同量的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，并均稀釋至同等體積，測定加標(biāo)樣品濃度并計(jì)算回收率，結(jié)果如表2所示?？梢钥闯觯貜?fù)性測定結(jié)果RSD=1.47%(n=10)，回收率在99.1～101.5%之間，表明本分光光度法測定γ-CD含量有較高的準(zhǔn)確度和可重復(fù)性[29]。

表1 γ-CD測定的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 γ-CD測定的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7 分光光度法與HPLC法測定γ-CD的比較

配制已知濃度(4.5 mmol/L的)γ-CD標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別采用1.3.3中的HPLC法及本文的分光光度測定法進(jìn)行濃度測定，每種測定方法平行測定五次。同時(shí), 將分光光度法測定的樣品結(jié)果與高效液相色譜法測定的結(jié)果進(jìn)行對比, 結(jié)果見表3。從表3中的數(shù)據(jù)可知，兩種方法的測定結(jié)果相當(dāng)吻合，分光光度法的平均測定值、標(biāo)準(zhǔn)偏差與(RSD)變異系數(shù)均與HPLC法相差很小，說明其在精準(zhǔn)度方面已經(jīng)十分接近色譜法。但由于分光光度測定法與HPLC法相比，具有操作簡便、測定快速、設(shè)備簡單，且對實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)水平要求不高等優(yōu)點(diǎn)，因此更易于推廣普及。

表3 分光光度法與HPLC法測定γ-CD 的結(jié)果比較

3 結(jié)論

首次以鄰甲酚酞(OCP)為探劑建立了基于OCP褪色反應(yīng)的γ-CD含量分光光度測定方法。當(dāng)OCP濃度為0.21 mmol/L，碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖溶液pH=9.51，30 ℃顯色15min時(shí)，減色程度ΔA與γ-CD濃度在0～15 mmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2=0.997 5。該測試方法靈敏度高，表觀摩爾吸光系數(shù)ε=3.06×103Lmol-1cm-1，檢出限為0.066 mmol/L。樣品平均實(shí)測回收率在99.1%～101.5%之間，測定結(jié)果RSD為1.47%(n=10)，具有良好的穩(wěn)定性與可重復(fù)性。此分光光度法與HPLC法的測定結(jié)果較為吻合，準(zhǔn)確度高，加之其測定方法簡便，測定快速、普及性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，有望成為一種新的γ-CD定量分析的有效工具，應(yīng)用于γ-環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)和加工中。