趙夢(mèng)瑞 方勤敏 黎繼烈 李培旺 張夢(mèng)君肖志紅 李昌珠 吳 紅 談泰猛 彭映暉

(經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；中南林業(yè)科技大學(xué)1，長(zhǎng)沙 410004) (湖南省林業(yè)科學(xué)院2，長(zhǎng)沙 410004)

油桐是我國(guó)本土木本油料樹(shù)種，歷史悠久。油桐具有生長(zhǎng)快，產(chǎn)量高，適應(yīng)性廣，種子含油率高且營(yíng)養(yǎng)豐富等優(yōu)點(diǎn)[1-2]。桐籽榨油后的主要副產(chǎn)物桐粕，含有蛋白質(zhì)36.3%～45%(浸出法)，是一種優(yōu)良的植物蛋白資源， 還有豐富的大量元素如P2O51.8%～2.7%，K2O 1.2%～1.3%，以及多種微量元素[3]。黃誠(chéng)[4]研究發(fā)現(xiàn)油桐粕中有皂角甙和佛波醇及其相關(guān)化學(xué)物質(zhì)兩種毒素，因此其飼用受到限制，長(zhǎng)久以來(lái)多作為餅肥還田使用。油桐粕作農(nóng)用肥肥效高且持久，有助于改良土壤的理化性質(zhì)，能夠在一定程度上規(guī)避對(duì)于化學(xué)肥料的依賴(lài)。但是經(jīng)傳統(tǒng)堆肥后施用，餅粕中大分子蛋白質(zhì)降解時(shí)間長(zhǎng)，存在著餅肥不符合植株生長(zhǎng)相應(yīng)的氮素供需規(guī)律、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率低的問(wèn)題[5-6]。相對(duì)于已有的一些改善大分子蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)的化學(xué)法和物理法，微生物發(fā)酵法具有消耗少，產(chǎn)率高，易操作和大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)，成為目前解決這個(gè)問(wèn)題一種有效方法。而微生物發(fā)酵的關(guān)鍵在于優(yōu)勢(shì)菌種的選育。但是目前關(guān)于油桐粕肥源化的研究和成果還比較少。方亭亭等[7]研究桐籽餅粕蛋白降解菌，篩選到三株對(duì)桐籽餅粕粗蛋白均表現(xiàn)出較強(qiáng)降解能力的白色短小桿菌B.licheniformis、地衣芽孢桿菌B.licheniformis和肉葡萄球菌C.albidum，但是并未對(duì)三株細(xì)菌進(jìn)行深入探究。本研究從自然發(fā)酵的油桐粕堆肥中，分離篩選能夠耐受桐粕毒素并高效降解油桐粕蛋白的菌株，從形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)水平，分析確定該菌株系統(tǒng)發(fā)育地位，研究其固態(tài)發(fā)酵油桐粕的最佳工藝參數(shù)，為提高油桐粕蛋白的營(yíng)養(yǎng)和應(yīng)用價(jià)值，以及油桐粕的肥源化再利用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

供試油桐餅粕：湖南國(guó)盛生物能源股份有限公司，測(cè)得該餅粕中蛋白質(zhì)含量為28.6%，含油率為7.2%，含水量為6.3%。

1.1.2 培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基[8]用于細(xì)菌的分離培養(yǎng)；油桐粕浸出汁培養(yǎng)基：油桐粕200 g，60～90 ℃下浸泡3～4 h，用8層紗布過(guò)濾除去殘?jiān)@得桐粕汁，定容至1 000 mL，pH自然，121℃滅菌20 min，用于菌株的初篩；油桐餅粕發(fā)酵底料：油桐餅粕和水按質(zhì)量比等比例混勻，500 mL錐形瓶裝量40 g，121 ℃滅菌20 min，滅菌2次，用于菌株的復(fù)篩。

1.2 主要試劑與儀器

細(xì)菌DNA提取試劑盒、DNA maker、dNTP、DNA聚合酶等：寶生物工程(大連)有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。超凈工作臺(tái)：天津市泰斯特儀器有限公司；PCR儀、凝膠成像儀：美國(guó)ABI公司；電泳儀：北京六一儀器廠；恒溫?fù)u床：上海智城分析儀器制造有限公司；K06C全自動(dòng)凱氏定氮儀：上海晟聲自動(dòng)化分析儀器有限公司；DIONEX P680高效液相色譜：美國(guó)戴安公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 評(píng)估指標(biāo)及其測(cè)定方法

粗蛋白百分含量和總蛋白氮含量的測(cè)定采用凱氏定氮法[9]：粗蛋白含量=蛋白氮含量×6.25。

氨基態(tài)氮的測(cè)定采用甲醛法[10-11]：精確稱(chēng)取油桐餅粕5 g于250 mL燒杯中，加入40 mL蒸餾水。電爐加熱煮沸2～3 min。冷卻至室溫，上清液轉(zhuǎn)移定容至50 mL容量瓶，吸取10 mL 上清液，使用pH計(jì)調(diào)至8.20后加入甲醛溶液10 mL，用0.5 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至9.20為終點(diǎn)，記下消耗氫氧化鈉體積并計(jì)算氨基態(tài)氮含量。同時(shí)做試劑空白實(shí)驗(yàn)，計(jì)算方法如下：

式中：Y為氨基態(tài)氮含量(以氮計(jì))/mg/g；V0為樣品加入甲醛后用去氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液數(shù)/mL；V為試劑空白加入甲醛后好用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液數(shù)/mL；Vl為吸取稀釋液數(shù)/mL；N為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度/mol/L；0.014為消耗1 mL NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)?shù)暮量水?dāng)量/g。

1.3.2 菌株的篩選

1.3.2.1 菌株的分離與初篩

取10 g自然堆積發(fā)酵的油桐餅粕接種到裝有90 mL無(wú)菌水的250 mL錐形瓶中，在30 ℃、180r/min下?lián)u床培養(yǎng)24 h，然后吸取1 mL懸浮液，用無(wú)菌水進(jìn)行系列梯度稀釋。分別吸取100 μL稀釋?xiě)腋∫?10-8～10-10)涂布至NA平板上，每個(gè)濃度重復(fù)3次。將平板置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)36 h，然后挑選形態(tài)各異的菌落進(jìn)行劃線純化處理，并對(duì)其進(jìn)行編號(hào)，保存于4 ℃下備用。

將分離得到的菌株分別接種至裝有50 mL NA液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，30 ℃、180 r/min下恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌水調(diào)整菌液濃度至108CFU/mL[12-13]，吸取5 mL菌液接種到裝有50 mL油桐粕浸出汁培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，30 ℃、180r/min下恒溫?fù)u床培養(yǎng)72 h，然后吸取1 mL懸浮液，用無(wú)菌水進(jìn)行系列梯度稀釋。分別吸取100 μL稀釋?xiě)腋∫和坎贾罭A平板上，每個(gè)濃度重復(fù)3次。將平板置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)36 h，采用稀釋平板法對(duì)候選菌株進(jìn)行計(jì)數(shù)[14]，選擇生長(zhǎng)狀況較好的菌株，保存于4 ℃下備用。

1.3.2.2 菌株的復(fù)篩

將初篩得到的候選菌株分別接種至裝有50 mL NA液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，30 ℃、180r/min下恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌水調(diào)整菌液濃度至108CFU/mL[12-13]，按40%(V/m)的接種量接種菌液至油桐粕發(fā)酵底料中，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d，每隔24 h進(jìn)行翻樣，每個(gè)菌株3組重復(fù)。發(fā)酵結(jié)束后，取出發(fā)酵物并在70 ℃下進(jìn)行烘干處理，測(cè)定發(fā)酵前后樣品中氨基態(tài)氮含量，對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出發(fā)酵效果比較好的菌株，進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

1.3.3 候選菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)觀察：將篩選得到的菌株劃線接種至NA培養(yǎng)基上，30 ℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長(zhǎng)形態(tài)，并進(jìn)行常規(guī)的革蘭氏染色。

生理生化鑒定：參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行菌株生理生化特征鑒定。

16S rRNA基因序列分析：利用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取候選菌株DNA，采用細(xì)菌擴(kuò)增通用引物[15]16SF和16SR擴(kuò)增細(xì)菌的16S rRNA；PCR反應(yīng)體系(50 μL)為10×PCR buffer 5 μL，DNA模板1 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，MgCl2(25 mmol/L)3 μL，引物(1 mmol/L)各 1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，加ddH2O 至50 μL；反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)，4 ℃ 保存。擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)定的序列在GenBank中進(jìn)行BLAST相似性比對(duì)，最后用MEGA 6.0的Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定候選菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位。

1.3.4 候選菌株固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化

1.3.4.1 種子液培養(yǎng)

將候選菌株接種至 NA液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min下恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，作為發(fā)酵種子液備用。

1.3.4.2 接種量選擇

對(duì)接種量(5%、10%、20%、30%、40%、50%)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵培養(yǎng)基中50%初始含水量，初始pH自然，溫度為35 ℃，時(shí)間4 d，每隔24 h進(jìn)行翻樣，每個(gè)處理重復(fù)3次。發(fā)酵優(yōu)化效果的評(píng)價(jià)以底物中氨基態(tài)氮含量為指標(biāo)，測(cè)定方法同1.3.2。

1.3.4.3 發(fā)酵溫度選擇

對(duì)溫度(25、30、35、40、45、50 ℃)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，選擇最優(yōu)接種量，其他條件與處理同1.3.4.2。

1.3.4.4 初始含水量選擇

對(duì)初始含水量(40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，選擇最優(yōu)溫度和接種量，其他條件與處理同1.3.4.2。

1.3.4.5 發(fā)酵時(shí)間選擇

對(duì)發(fā)酵時(shí)間(2、3、4、5、6、7、8 d)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，選擇最優(yōu)接種量、初始含水量和溫度，其他條件與處理同1.3.4.2。

1.3.5 發(fā)酵前后游離氨基酸成分及含量檢測(cè)

采用高效液相色譜法對(duì)油桐餅粕及其在最優(yōu)發(fā)酵條件下的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行游離氨基酸組成和含量的測(cè)定，參照劉躍芹等[16]建立的測(cè)定方法和GB 5009.124—2016，并對(duì)產(chǎn)物中氨基酸的變化進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離與篩選

2.1.1 菌株的初篩

通過(guò)稀釋平板涂布法從堆積發(fā)酵的油桐餅粕中分離到12株細(xì)菌；初篩結(jié)果見(jiàn)表1，有7株細(xì)菌在培養(yǎng)72 h后的生物量較高，分別為L(zhǎng)YT-1、LYT-2、LYT-3、LYT-4、LYT-5、LYT-8和LYT-9，其中，菌株LYT-1的生物量最高，達(dá)到(2.67±0.22)×107CFU/mL，這可能與細(xì)菌自身的生長(zhǎng)和代謝水平受桐粕浸出汁中營(yíng)養(yǎng)成分和有毒物質(zhì)的影響有關(guān)。因此，選取初篩得到的7株細(xì)菌進(jìn)行進(jìn)一步的發(fā)酵復(fù)篩。

表1 分離菌株的生物量差異情況

2.1.2 菌株的復(fù)篩

對(duì)初篩得到的菌株進(jìn)行發(fā)酵復(fù)篩，桐粕中氨基態(tài)氮含量變化如圖1所示，在相同的發(fā)酵條件下，7株菌株發(fā)酵后底物中氨基態(tài)氮含量均有提高，其中LYT-1菌株發(fā)酵效果最好，氨基態(tài)氮含量達(dá)到19.3 mg/g，增長(zhǎng)了11.1倍，因此選取發(fā)酵效果較好的LYT-1菌株進(jìn)行下一步的研究工作。

圖1 油桐餅粕發(fā)酵前后的氨基態(tài)氮含量

2.2 候選菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征

LYT-1菌株在NA平板上30 ℃培養(yǎng)24 h，菌落形態(tài)見(jiàn)圖2a，呈污白色，圓形和橢圓，表面粗糙、有突起，且不透明，菌落直徑約(5.5±0.5) mm；革蘭氏染色呈陽(yáng)性，見(jiàn)圖2b，為革蘭氏陽(yáng)性菌；芽孢染色顯示有芽孢生成，見(jiàn)圖2c。

圖2 菌株LYT-1的形態(tài)學(xué)特征

2.2.2 生理生化特征

LYT-1菌株的部分生理生化特征測(cè)定結(jié)果如表2所示，該菌株能夠降解無(wú)機(jī)磷和纖維素，明膠液化和硝酸鹽還原反應(yīng)結(jié)果呈陽(yáng)性，但對(duì)產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)和產(chǎn)吲哚實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均為陰性。

表2 生理生化特征

注：“+”代表反應(yīng)為陽(yáng)性，“-”代表反應(yīng)為陰性。

2.2.3 16S rRNA基因分子鑒定

經(jīng)DNA提取，PCR擴(kuò)增和測(cè)序獲得的16S rRNA基因的片段大小為1 327 bp。在GenBank上進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示菌株LYT-1與枯草芽孢桿菌序列相似性達(dá)到 99%。從GenBank中分別調(diào)取芽孢桿菌屬不同種的11株標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rRNA基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)，菌株LYT-1與枯草芽孢桿菌的親源關(guān)系最近，提交序列后獲得登錄號(hào)為KY626046。結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特征鑒定和16S rRNA序列分析結(jié)果，確定菌株LYT-1為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

圖3 基于16S rRNA基因序列相似性構(gòu)建的
菌株LYT-1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 菌株固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 最佳接種量和發(fā)酵溫度的確定

由圖4可知，當(dāng)接種量在30%時(shí)，油桐粕發(fā)酵后氨基態(tài)氮含量最高，達(dá)到30.0 mg/g；在接種量30%條件下，當(dāng)發(fā)酵溫度為45 ℃時(shí)，油桐粕發(fā)酵后氨基態(tài)氮含量最高，達(dá)到33.7 mg/g。因此初步確定最佳接種量和發(fā)酵溫度分別為30%和45 ℃。

圖4 最佳發(fā)酵溫度和接種量的確定

2.3.2 最佳初始含水量和發(fā)酵時(shí)間的確定

由圖5可知，在接種量30%、發(fā)酵溫度45 ℃條件下，初始含水量為60%時(shí)，油桐粕發(fā)酵后氨基態(tài)氮含量最高，達(dá)到36.3 mg/g；在接種量30%、發(fā)酵溫度45 ℃、初始含水量60%條件下，發(fā)酵時(shí)間為7 d時(shí)，油桐粕發(fā)酵產(chǎn)物中氨基態(tài)氮含量最高，達(dá)到40.6 mg/g，對(duì)比發(fā)酵前具有顯著提高。

圖5 最佳初始含水量和發(fā)酵時(shí)間的確定

2.4 油桐粕發(fā)酵前與其發(fā)酵產(chǎn)物中的游離氨基酸分析

樣品中檢測(cè)到17種氨基酸組份見(jiàn)表3，由檢測(cè)結(jié)果可知，固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化后游離氨基酸總含量顯著增加，相比發(fā)酵前提高了24.5倍。各種氨基酸的含量也均有增加，其中谷氨酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸和亮氨酸的含量增幅較大。

表3 游離氨基酸的組成及含量

3 討論

綠色有機(jī)肥是未來(lái)生態(tài)農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要方向。高氮、磷、鉀含量的油桐粕是一種可開(kāi)發(fā)利用的優(yōu)良植物肥料基質(zhì)。本研究從自然發(fā)酵的油桐粕堆肥中篩選得到1株降解油桐粕蛋白效果較好的的枯草芽孢桿菌LYT-1，探究了初始含水量、接種量、發(fā)酵溫度和時(shí)間對(duì)該菌株發(fā)酵效果的影響，發(fā)現(xiàn)不同發(fā)酵條件下發(fā)酵效果具有差異性。通過(guò)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示優(yōu)化后桐粕發(fā)酵產(chǎn)物中氨基態(tài)氮含量顯著提高。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一類(lèi)革蘭氏陽(yáng)性桿狀好氧型細(xì)菌，可以產(chǎn)生內(nèi)生芽孢，其適應(yīng)能力強(qiáng)，應(yīng)用性廣，沒(méi)有致病性，對(duì)環(huán)境和人畜無(wú)害，是我國(guó)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)使用的一種允許使用且可以直接飼喂動(dòng)物的益生菌[17]?？莶菅挎邨U菌可產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等多種消化酶，在形成芽孢過(guò)程中可分泌多種抗生素，因此，枯草芽孢桿菌是一種理想的生物有機(jī)肥發(fā)酵菌種。由于枯草芽孢桿菌自身的優(yōu)良特性，近年來(lái)引起了人們的廣泛關(guān)注。本研究篩選到的枯草芽孢桿菌LYT-1，能夠有效降解油桐粕中大分子蛋白質(zhì)為易被植物吸收利用的氨基酸和小肽類(lèi)物質(zhì)的同時(shí)還具有解磷和降解纖維素的能力。將其用于生物有機(jī)肥的制備，既能降解餅粕中纖維素從而提高還原糖含量，又可以幫助分解土壤中的無(wú)機(jī)磷以促進(jìn)作物的生長(zhǎng)，從而提高桐粕肥的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。因此，枯草芽孢桿菌LYT-1在油桐粕肥及其他生物肥的發(fā)酵生產(chǎn)中都有很好的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。該菌株的其他特性以及在生產(chǎn)上的應(yīng)用效果有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

4.1 以自然發(fā)酵的油桐粕堆肥為菌種來(lái)源，通過(guò)稀釋平板涂布法和劃線分離法篩選到1株高效降解油桐粕蛋白的細(xì)菌LYT-1。通過(guò)進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rRNA序列分析，初步鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

4.2 對(duì)該菌株固態(tài)發(fā)酵油桐粕的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以氨基態(tài)氮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得到最佳條件為：接種量30%、初始含水量60%、發(fā)酵溫度45 ℃、發(fā)酵時(shí)間7 d。在此發(fā)酵條件下，氨基態(tài)氮含量達(dá)到40.6 mg/g，是優(yōu)化前氨基態(tài)氮含量的2.1倍，比發(fā)酵前提高了24.6倍。

4.3 檢測(cè)發(fā)酵優(yōu)化前后油桐粕中游離氨基酸成分和含量，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后游離氨基酸總量顯著增加，較之前提高了24.5倍，表明用枯草芽孢桿菌LYT-1發(fā)酵能夠有效地降解油桐粕蛋白并改善其營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)。