崔 晉 馬艷弘 黃開(kāi)紅 曹培杰 殷劍美 司衛(wèi)東

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所1， 南京 210014) (山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院2，太谷 030801) (江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所3，南京 21001) (江蘇博達(dá)生物科技有限公司4，徐州 221723)

紫山藥(Dioscoreaalata)是薯蕷科(Dioscoreae)山藥屬(DioscoreaL.)一年生或多年生蔓生植物，又名參薯、腳板薯等，是我國(guó)重要的地方特色經(jīng)濟(jì)作物。紫山藥是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種藥食同源植物，屬于紫紅肉山藥品種，研究表明紫山藥中主要的活性成分多糖含量高于其他品種[1-4]，花青素、礦質(zhì)元素含量均較高[5-6]，因此具有很好的市場(chǎng)前景。

《本草綱目》記載紫山藥具有補(bǔ)脾胃、益肺腎、消渴，可治氣虛衰弱、慢性泄瀉、虛勞咳嗽等病癥，對(duì)虛弱、慢性腸胃炎、糖尿病等也有一定的療效，長(zhǎng)期服用可以抗病、強(qiáng)身[7]。目前市場(chǎng)上紫山藥產(chǎn)品比較單一，主要以鮮食或加工成紫山藥粉為主，紫山藥發(fā)酵飲料等高附加值產(chǎn)品鮮有報(bào)道。因紫山藥中含有大量的淀粉[8]，在制備紫山藥發(fā)酵飲料、紫山藥酒等產(chǎn)品的過(guò)程中，微生物不能直接利用淀粉，需要通過(guò)酶解技術(shù)將紫山藥中的淀粉轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的糖，才有利于微生物發(fā)酵?？梢?jiàn)采用淀粉酶解技術(shù)不僅有利于提高淀粉的水解率會(huì)使原料營(yíng)養(yǎng)利用最大化、還有利于改善其口感、增強(qiáng)產(chǎn)品穩(wěn)定性，提高紫山藥中的花青素等生物活性的高效利用。

淀粉酶解是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，會(huì)受到底物濃度、酶濃度、pH、反應(yīng)溫度與時(shí)間等因素的影響，應(yīng)用米氏方程確定酶反應(yīng)速度與底物濃度的動(dòng)力學(xué)模型已應(yīng)用于馬鈴薯、玉米、高粱、蕎麥等淀粉的酶解[9-11]，但紫山藥淀粉的酶解工藝及其動(dòng)力學(xué)研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究以紫山藥淀粉為材料，利用α-淀粉酶進(jìn)行酶解，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面分析法對(duì)其酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)酶解動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行了研究，為紫山藥淀粉的水解及其相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫山藥：蘇蕷1號(hào)，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院南京市六合實(shí)驗(yàn)基地提供。

α-淀粉酶(枯草桿菌，酶活力4 000 U/g，60～70 ℃)：南京建安實(shí)業(yè)有限公司；碳酸氫鈉、氫氧化鈉：滄州建宇化工有限公司；鹽酸：濟(jì)南英出化工有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

MJ-BL15U11破壁攪拌機(jī)：廣東美的電器制造有限公司；FE20 pH計(jì)：梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司；LXJ-IIB離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；D-8紫外分光光度計(jì)：南京菲勒儀器有限公司。

1.3 紫山藥酶解實(shí)驗(yàn)

將新鮮紫山藥清洗、切片后蒸30 min，按料水比1∶4混合，打漿得紫山藥漿液。將紫山藥樣液調(diào)節(jié)pH，加入α-淀粉酶混勻后，水浴一定時(shí)間后取出，沸水浴滅活5 min，冷卻至室溫。將樣液進(jìn)行離心，取稀釋后的上清液進(jìn)行還原糖的測(cè)定。

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在pH為6.5，溫度65 ℃，時(shí)間90 min條件下，考察不同α-淀粉酶添加量(10、15、20、25、30、35 U/g)對(duì)還原糖釋放率DE值的影響；在α-淀粉酶添加量25 U/g, 溫度65 ℃，時(shí)間90 min條件下，考察不同pH(4.5、5.5、6.5、7.5、8.5)對(duì)還原糖釋放率DE值的影響；在α-淀粉酶添加量25 U/g，pH為6.5，時(shí)間90 min條件下，考察不同反應(yīng)溫度(45、55、65、75、85 ℃)對(duì)還原糖釋放率DE值的影響；在α-淀粉酶添加量25 U/g，pH為6.5，溫度65 ℃條件下，考察不同酶解時(shí)間(30、50、70、90、110、130 min)對(duì)還原糖釋放率DE值的影響。

1.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken方案，以α-淀粉酶、pH、酶解溫度、時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，以DE為響應(yīng)值，利用Design-Expert8.05軟件優(yōu)化酶解工藝參數(shù)。因素水平表見(jiàn)表 1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平編碼表

1.4 還原糖釋放率DE值的測(cè)定

DE值是衡量紫山藥酶解過(guò)程中淀粉的水解程度，即漿液中淀粉轉(zhuǎn)化的還原糖占淀粉含量的百分率[12]，按照陳鷹等[13-14]的方法將紫山藥淀粉進(jìn)行酸水解，采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖含量，按照式(1)計(jì)算DE值：

式中：A為酶解后還原糖含量；B為紫山藥原有還原糖；C為酸水解后還原糖含量。

1.5 紫山藥的α-淀粉酶酶解動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

將新鮮紫山藥清洗，切片后蒸30 min，按原料水比2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4混合打漿，得到紫山藥漿液，按照響應(yīng)面所得最佳參數(shù)調(diào)節(jié) pH值，加入 α-淀粉酶混勻，恒定溫度酶解10 min后立刻沸水浴滅活5 min，離心后取上清液，按照式(2)計(jì)算還原糖釋放量，參考高義霞[15-16]等的方法，按式(3)計(jì)算反應(yīng)速率。

還原糖釋放量(mg/mL)=酶解后測(cè)定值-紫山藥本身還原糖

式中：v為反應(yīng)速率/mg/(mL·min)；m/V為還原糖質(zhì)量濃度/mg/mL；t為反應(yīng)時(shí)間/min。

1.6 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型[15-16]

Michaelis和Menten根據(jù)快速平衡學(xué)說(shuō)建立米氏方程。Briggs和 Haldane用穩(wěn)態(tài)代替快速平衡態(tài)，得到更合理的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)過(guò)程：

由于酶促反應(yīng)的速度與ES的形成與分解直接相關(guān)所以在考察酶促反應(yīng)速度時(shí),必須同時(shí)考慮ES的形成速度與分解速度。通過(guò)推導(dǎo)將米氏方程修正為：

線性化處理后得Lineweaver-Burk 方程：

式中：v為反應(yīng)速度；Vmax為最大反應(yīng)速度；[S]為底物濃度；Km為米氏常數(shù)，Km為(K2+K3)/K1。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同α-淀粉酶添加量、pH、酶解溫度、時(shí)間對(duì)DE值的影響

由圖1可知，當(dāng)酶添加量低于25 U/g時(shí)，DE隨著酶添加量的增加而升高；當(dāng)酶添加量大于25 U/g時(shí)，DE變化趨于平緩，由此說(shuō)明酶添加量達(dá)到25 U/g時(shí)，紫山藥淀粉已經(jīng)基本酶解完全，底物已經(jīng)耗完，再增加酶用量對(duì)DE值的影響不大，考慮到經(jīng)濟(jì)效益和酶解效果，選擇25 U/g時(shí)為酶解的最佳酶添加量。

pH影響酶分子構(gòu)象的穩(wěn)定性和極性基團(tuán)的解離狀態(tài)，從而影響酶分子的構(gòu)象以及酶與底物的結(jié)合能力和催化能力[15]。由圖1可知，在pH 4.5～5.5范圍內(nèi)，DE值隨著pH的上升而增加，pH大于5.5，DE值反而隨著pH值的升高而下降。因此，酶解的最適宜pH值為5.5。

由圖1可知，在45～85 ℃范圍之間，DE值隨著酶解溫度的升高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在45～65 ℃范圍內(nèi)，DE值隨溫度升高而升高，當(dāng)溫度達(dá)到65 ℃時(shí)，DE值達(dá)最大；超過(guò)65 ℃，DE值開(kāi)始隨溫度升高而有所下降?？梢?jiàn)，過(guò)高或過(guò)低的溫度都會(huì)降低酶的催化效率，這是因?yàn)闇囟冗^(guò)高會(huì)導(dǎo)致酶的失活從而造成催化作用完全喪失；同時(shí)作用溫度越高，還原糖與氨基酸越容易發(fā)生氨基糖反應(yīng)，還原糖之間也會(huì)發(fā)生焦糖化反應(yīng)，造成糖分的直接損失。因此65 ℃為紫山藥淀粉的適宜酶解溫度。

由圖1可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶與底物的接觸和反應(yīng)越來(lái)越充分，產(chǎn)生的還原糖釋放率DE越來(lái)越高，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為70 min時(shí)，DE值達(dá)最大；超過(guò)70 min后，DE值變化逐漸下降。因此，70 min為紫山藥淀粉最佳酶解時(shí)間。

圖1 不同α-淀粉酶添加量、pH、酶解溫度、時(shí)間對(duì)DE值的影響

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝條件

2.2.1 回歸模型建立與方差分析

根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以DE為響應(yīng)值，優(yōu)化紫山藥淀粉酶解的酶解工藝。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。以DE值為響應(yīng)值(Y)，利用 Design Expert8.05軟件對(duì)表中數(shù)據(jù)進(jìn)行了二次多元回歸擬合，得到響應(yīng)值Y對(duì)自變量的多元回歸方程為：Y=27.73-1.03A-1.39B+2.00C+1.97D+0.97AB-2.74AC-2.86AD-1.92BC+3.40BD+0.95CD-5.69A2-8.90B2-4.55C2-1.37D2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表

注：*表示0.05水平顯著，**表示0.01水平顯著。

2.2.2 紫山藥淀粉酶解響應(yīng)面圖分析與優(yōu)化

繪制加酶量、酶解時(shí)間、pH和酶解溫度4個(gè)變量之間交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖，響應(yīng)曲面圖中的曲面的陡峭程度可以表明變量對(duì)DE的影響程度，曲面較陡峭表明影響較大，反之則較??；等高線圖反映了因素間交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形表示交互作用顯著，圓形表示交互作用不顯著[18]。通過(guò)響應(yīng)面圖分析：加酶量和酶解時(shí)間、pH和酶解溫度、加酶量和溫度的交互作用的響應(yīng)面坡度較陡，等高線均呈現(xiàn)橢圓、扁平狀，上述因素之間的相互作用顯著。

2.2.3 最優(yōu)提取工藝條件及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

經(jīng)軟件分析得到紫山藥淀粉酶解最優(yōu)工藝為：α-淀粉酶酶添加量為22.82 U/g，pH為5.58，時(shí)間為76.87 min，溫度為75 ℃時(shí)，為了操作方便，修正最佳的提取條件為：加酶量23 U/g、pH 5.5、時(shí)間為77 min、溫度為75 ℃，在這個(gè)條件下，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，所得紫山藥淀粉酶解得率平均值為27.17%。實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值29.46%相對(duì)誤差僅為2.29%，因此證明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃侠?，?shí)驗(yàn)結(jié)果理想。

2.3 紫山藥淀粉酶解動(dòng)力學(xué)方程及參數(shù)求解

2.3.1 Lineweaver-Buck法求解參數(shù)

在淀粉濃度較低時(shí)，酶未被底物飽和，反應(yīng)速率與淀粉濃度呈正比關(guān)系，表現(xiàn)為一級(jí)反應(yīng); 隨后繼續(xù)增大淀粉濃度，反應(yīng)速率不再呈正比增加，表現(xiàn)為混合級(jí)反應(yīng); 當(dāng)?shù)矸蹪舛仍鲋料喈?dāng)高時(shí)，淀粉濃度對(duì)反應(yīng)速率影響變小，平衡時(shí)達(dá)到最大反應(yīng)速率，表現(xiàn)為零級(jí)反應(yīng)，這表明紫山藥淀粉的酶解遵循米氏酶中間絡(luò)合物學(xué)說(shuō)，可用米氏方程進(jìn)行擬合[19]。

求得Km=7.94 mg/mL，Vm=6.98 mg/(mL·min)，方程為=6.98[S]/(7.94+[S])，R2=0.996 6，方程極顯著。

圖2 底物濃度與反應(yīng)速率的關(guān)系

2.3.2 Wilkinson統(tǒng)計(jì)法求解參數(shù)

Wilkinson統(tǒng)計(jì)法包括非線性二乘法求估算解和泰勒展開(kāi)式求精校解兩步。

2.3.2.1 最小二乘法求估算解

由表4知，Δ=αε-γδ=0.17303，Vm0=(βε-δ2)/=3.940 mg/(mL·min)，Km0=(βγ-αδ)/Δ=4.034 mg / mL。式中Vm0和Km0分別為最大反應(yīng)速度和米氏常數(shù)估算值。

表4 Wilkinson 統(tǒng)計(jì)法求估算解

表5 Wilkinson法精校解

2.3.2.2 泰勒展開(kāi)式求精校解

由表5可知，Δ=α′′-γ′2=0.003 3，b1=(′′-′′)/′=1.051，b2=(′′-′′)/′=0.309，求得精確解為Vm=Vm0b1=4.141 3；Km=Km0+b2/b1=4.328 4。

2.3.3 Lineweaver-Buck法和Wilkinson統(tǒng)計(jì)法的比較

Lineweaver- Buck法和Wilkinson統(tǒng)計(jì)法計(jì)算得到的Vm和Km有一定的差別。這是因?yàn)榍罢叩膶?shí)驗(yàn)點(diǎn)過(guò)分集中在直線左下方原點(diǎn)處，在淀粉濃度很低時(shí)，其取倒數(shù)后誤差較大，往往偏離直線較遠(yuǎn)。[S]適合范圍一般為在0.33～2Km，因此，即使采用最小二乘法線性回歸分析，也將影響Km和Vm的準(zhǔn)確性，但該法方便快速，計(jì)算量小。Wilkinson 統(tǒng)計(jì)法被認(rèn)為計(jì)算結(jié)果可靠[20]，但過(guò)程冗余且復(fù)雜。

經(jīng)分析比較，實(shí)驗(yàn)最終采用 Wilkin-son 統(tǒng)計(jì)法求解結(jié)果，即Vm=4.141 mg / ( mL·min) ，Km=4.329 mg/mL。α-淀粉酶酶解紫山藥淀粉的動(dòng)力學(xué)方程為v=4.141[S]/(4.329+[S])。

2.3.4 Ea計(jì)算

在45～75 ℃范圍內(nèi)，反應(yīng)速率隨溫度的增加而增大，以 lnv 對(duì)1/T(x103) 作圖，呈直線關(guān)系，用阿累尼烏斯(Arrhenius) 方程擬合:

式中:R為氣體常數(shù) 8.31 J/( mol·K);Ea為活化能/kJ·mol; B為積分常數(shù)。將式寫成指數(shù)形式，K3=A×exp(-Ea/RT) ，A為前指因子/mg/(mL·min) ?；貧w方程為Y=11.859-4.220X，R2=0.991，得Ea=35.067 kJ/mol，A=141 350.796 mg/(mL·min) ，R2=0.991，表明Arrhenius 方程對(duì)該數(shù)據(jù)的擬合是極顯著的。

圖3 回歸方程

3 結(jié)論

在單因素的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面分析法對(duì)紫山藥淀粉的酶解工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定了紫山藥淀粉酶解最佳優(yōu)化工藝條件為：α-淀粉酶添加量為23 U/g，酶解溫度75 ℃，酶解pH為5.5，酶解時(shí)間為77 min，在此工藝條件下，還原糖釋放率DE值達(dá)27.17% 。其酶解反應(yīng)遵循米氏酶中間絡(luò)合物學(xué)說(shuō)，可用米氏方程進(jìn)行擬合。采用Lineweaver-Buck 法和 Wilkinson統(tǒng)計(jì)法均可求解動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vm，且Wilkinson 統(tǒng)計(jì)法更為可靠，所得Vm為4.141mg/(mL·min) ，Km為4.329 mg/mL，其酶解動(dòng)力學(xué)方程為=6.98[S]/(7.94+[S])，R=0.996 6，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯著該模型高度顯著，可以很好的對(duì)紫山藥淀粉酶解效率進(jìn)行預(yù)測(cè)。