鞠守勇，陳其國(guó)

(武漢職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，湖北武漢 430070)

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)是一種以細(xì)菌為食的自由生活的線蟲，廣泛存在土壤和堆肥中[1]。 1963年Sydney B首次把C.elegans作為模式生物用于研究動(dòng)物發(fā)育和行為的模式動(dòng)物，現(xiàn)已經(jīng)發(fā)展成為研究動(dòng)物發(fā)育、神經(jīng)、衰老、毒理學(xué)、脂肪沉積和天然免疫等方面重要的模式生物[1]。近些年來(lái)，以C.elegans作為病原菌宿主模型來(lái)研究病原菌與宿主的相互作用逐漸成為了一個(gè)新的熱點(diǎn)，C.elegans作為病原菌宿主模型有很多優(yōu)勢(shì)，個(gè)體小，成蟲的長(zhǎng)度大約1.5 mm；生長(zhǎng)快，3 d～3.5 d就可以長(zhǎng)成成蟲；繁殖快，成熟的線蟲每次可以獲得300個(gè)～350個(gè)子代個(gè)體；培養(yǎng)簡(jiǎn)單，可以直接以要研究的細(xì)菌為食物[1]；基因組測(cè)序已經(jīng)完成；基因操作系統(tǒng)完善，突變體數(shù)量齊備，轉(zhuǎn)基因線蟲和RNAi技術(shù)成熟；表型易觀察等特征[2]。目前，C.elegans作為病原菌宿主模型，在病原菌的致病機(jī)制和宿主防御病原菌天然免疫等方面取得了一系列的進(jìn)展。本文就近些年來(lái)利用線蟲作為宿主模型，在重要病原菌的致病機(jī)制和線蟲天然免疫信號(hào)通路取得的進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1　以C.elegans為宿主模型研究病原菌致病機(jī)制

1999 年，Ausubel F M實(shí)驗(yàn)室Tan M W等[3]開創(chuàng)了以銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)感染C.elegans為模型來(lái)研究致病菌的致病機(jī)制。目前，以C.elegans為模式宿主進(jìn)行研究的病原菌有真菌、細(xì)菌、病毒等，有50多種(表1)。其中研究較深入的主要是一些人類病原菌，如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)[3]、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)[4]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[5-6]、黏質(zhì)沙雷菌(Serratiamarcescens)[7]、鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium)[8]、鼠疫耶爾森菌(Yersiniapestis)[9]等病原菌，還有一些農(nóng)業(yè)中具有重要應(yīng)用價(jià)值的殺線蟲微生物，如厚垣普奇尼亞菌(Pochoniachlamydosporia)、淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus)[10]、蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)[11]等。

1.1　銅綠假單胞菌

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)在自然界分布廣泛，是醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原菌之一，可以引起術(shù)后傷口感染，也可引起褥瘡、膿腫、化膿性中耳炎等[3]。1999年Ausubel F M實(shí)驗(yàn)室首先以C.elegans作為宿主模型來(lái)研究PA的致病機(jī)制，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)PA殺線蟲的機(jī)制至少有4種方式。

1.1.1緩慢致死方式PA生長(zhǎng)在C.elegans培養(yǎng)基(NGM)中，進(jìn)入線蟲體內(nèi)后，在腸道里生長(zhǎng)繁殖且形成生物膜，當(dāng)PA在線蟲腸道中聚集到線蟲難以清除的數(shù)量后，PA就會(huì)在線蟲腸道中大量增生從而緩慢殺死線蟲[3]。

1.1.2快速致死方式研究發(fā)現(xiàn)，PA在營(yíng)養(yǎng)豐富的高滲固體培養(yǎng)基中，毒殺線蟲的速度大大加快，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PA在營(yíng)養(yǎng)豐富培養(yǎng)基中會(huì)分泌多種噻吩類物質(zhì)等小分子毒素，直接快速殺死線蟲；PA弱毒菌PAO1在腦心浸液固體培養(yǎng)基中產(chǎn)生小分子氰化氫神經(jīng)毒素快速殺死線蟲[12]。

1.1.3紅色死亡方式PA在缺乏磷的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)程中，可以通過(guò)蛋白PhoB激活其磷酸攝入系統(tǒng)，誘導(dǎo)群體數(shù)量感應(yīng)系統(tǒng)(quorum-sensing pathways)，激活PA中的鐵載體蛋白，搶奪線蟲細(xì)胞中的Fe3+導(dǎo)致線蟲缺Fe3+死亡，因死亡線蟲的咽部和腸道組織內(nèi)往往觀察到紅色，這種死亡方式命名為“紅色死亡”[13]。

1.1.4液體死亡方式2013年Kirienko N V等[14]在液體環(huán)境下用PA毒殺線蟲時(shí)，發(fā)現(xiàn)PA在線蟲體內(nèi)沒有進(jìn)行增殖，也沒有激活PA的群體數(shù)量信號(hào)系統(tǒng)，熒光鐵載體多肽和雙組份系統(tǒng)也沒有被激活，整個(gè)PA毒殺過(guò)程中也不產(chǎn)生噻吩類化合物；PA在液體環(huán)境下作用于線蟲的過(guò)程中，線蟲啟動(dòng)缺氧應(yīng)答因子HIF-1防御PA， PA在液體中毒殺線蟲的具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

PA不但可以產(chǎn)生毒素殺死線蟲，而且可以成功躲避線蟲天然免疫系統(tǒng)，PA可以通過(guò)自身的GacA雙組份調(diào)控系統(tǒng)和LasR、RhlR群體數(shù)量感應(yīng)系統(tǒng)分泌出一些物質(zhì)，誘導(dǎo)線蟲分泌胰島素類似蛋白INS-7，INS-7可以與DAF-2受體蛋白結(jié)合，從而抑制FOXO轉(zhuǎn)錄因子DAF-16進(jìn)入細(xì)胞核中，不能激活免疫防御相關(guān)基因thn-2、lys-7和spp-1等，成功定植線蟲腸道[15]。

1.2　糞腸球菌

糞腸球菌(Enterococcusfaecalis，Ef)是人體腸胃中的條件性致病菌，嚴(yán)重時(shí)可以引起人心臟內(nèi)膜炎，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)對(duì)多種藥物具有抗性的菌株[16]。Ef殺線蟲的主要機(jī)制是在線蟲的腸道中大量增殖，從而引起腸道腫脹，殺死線蟲個(gè)體；Ef毒殺線蟲的關(guān)鍵致病因子主要是溶細(xì)胞素(Cyl)，其中群體感應(yīng)系統(tǒng)fsr/gelE-sprE也參與了對(duì)線蟲的感染，Ef侵染線蟲后，線蟲增加體內(nèi)的活性氧(reactive oxy gen species，ROS)來(lái)抵御細(xì)菌的感染[4]。

1.3　黏質(zhì)沙雷菌

黏質(zhì)沙雷菌(Serratiamarcescens，Sm)是一種廣宿主條件致病菌，可以感染植物、無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物等，近年來(lái)，由于抗生素抗性菌株的出現(xiàn)，Sm對(duì)人類健康的威脅越來(lái)越嚴(yán)重[7]。以C.elegans為宿主模型研究發(fā)現(xiàn)，Sm可以成功逃避線蟲口器的咀嚼，定植于線蟲腸道，6 d后導(dǎo)致腸道腫脹而死，少量細(xì)菌也可以定植于線蟲的生殖器[17]，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，線蟲可以大量表達(dá)一些類似免疫蛋白抵御Sm，例如TGF-β信號(hào)通路調(diào)控的溶菌酶、凝集素等[18]。

1.4　金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，Sa)可以引起人傷口的嚴(yán)重感染，產(chǎn)生毒素，進(jìn)入人體腸道后引起腸炎、嘔吐、發(fā)熱、腹瀉等癥狀[19]。Sa可在線蟲腸道中聚集，破壞腸道上皮組織，最終導(dǎo)致線蟲死亡[20]，通過(guò)構(gòu)建Sa的插入突變體，發(fā)現(xiàn)Sa毒力調(diào)控基因agr和sarA缺失后，對(duì)線蟲的毒力明顯降低，進(jìn)一步研究表明，毒力調(diào)控基調(diào)控子和下游基因V8蛋白酶、α-溶血素對(duì)Sa感染線蟲必須的[19]；初期感染的線蟲轉(zhuǎn)移到無(wú)毒細(xì)菌后，線蟲可以排出腸道中定植的Sa恢復(fù)健康[20]；線蟲通過(guò)β-連環(huán)蛋白Bar-1調(diào)控下游基因egl-5抵御Sa的侵染[21]。

1.5　蘇云金芽胞桿菌

蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)典型的特征在芽胞后期形成一種伴胞晶體蛋白(crystal proteins，Cry)，大多數(shù)晶體蛋白具有毒殺特定的昆蟲、線蟲等害蟲的特點(diǎn)，該特征使Bt廣泛用于防治農(nóng)業(yè)害蟲、林業(yè)害蟲、儲(chǔ)藏害蟲和衛(wèi)生害蟲[22]。2000年美國(guó)加州大學(xué)Aroian R實(shí)驗(yàn)室首先利用C.elegans為宿主模型來(lái)研究Bt殺蟲機(jī)制[23]；通過(guò)EMS誘變線蟲篩選到了對(duì)Cry5B有抗性的基因，從而發(fā)現(xiàn)了Cry5B在線蟲的新受體是無(wú)脊椎動(dòng)物所特有的糖脂，同時(shí)也在昆蟲中發(fā)現(xiàn)糖脂可以與Cry蛋白相互作用[24]。隨后發(fā)現(xiàn)線蟲抵御Cry5B蛋白的多個(gè)信號(hào)通路,包括P38/MAPK、C-JNK/MAPK信號(hào)通路，未折疊蛋白應(yīng)答(unfolded protein response (UPR) )通路，Daf-2/Daf-16信號(hào)通路等[25]，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)線蟲低氧應(yīng)答機(jī)制(low oxygen response)、囊泡運(yùn)輸修復(fù)系統(tǒng)也參與了對(duì)Cry5B穿孔毒素的防御[25]。有趣的是含有Cry5B的野生Bt菌株YBT-1518在環(huán)境中毒素Cry5B處于沉默狀態(tài)，當(dāng)YBT-1518進(jìn)入到線蟲體內(nèi)后，會(huì)大量表達(dá)原本沉默的毒素Cry5B，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，新型sRNA BtsR1負(fù)調(diào)控了Cry5Ba導(dǎo)致其在非宿主環(huán)境下沉默，該表型可掩蓋Bt的毒性以欺騙線蟲的拒食行為，使Bt更易被線蟲取食，當(dāng)Bt被取食進(jìn)入宿主后該沉默現(xiàn)象解除，Cry5Ba大量表達(dá)并迅速殺死線蟲，使Bt取得生存優(yōu)勢(shì)，該新發(fā)現(xiàn)揭示了一種新型的病原菌逃避宿主趨避防御行為的策略[26]。

表1　秀麗隱桿線蟲的病原菌

續(xù)表1

項(xiàng)目 Item秀麗隱桿線蟲病原菌Pathogens of C.elegans毒殺機(jī)制Pathogenic mechanism人類病原菌Human pathogen? Streptococcus mitis(Viridans group)侵染腸道;毒素Gut infection;toxin是Yes Streptococcus oralis侵染腸道;毒素Gut infection;toxin是Yes 革蘭陽(yáng)性細(xì)菌G+ bacteriaStreptococcus pneumoniae侵染腸道;毒素Gut infection;toxin是Yes Streptococcus pyogenes(Group A)侵染腸道;毒素Gut infection;toxin是Yes Streptoverticillium albireticuli侵染腸道;毒素Gut infection;toxin是Yes

2　秀麗隱桿線蟲抵御病原菌的天然免疫通路

C.elegans不但是研究病原菌致病機(jī)制的理想宿主模型，同時(shí)也是研究宿主天然免疫信號(hào)通路的理想模型[27]。近幾年，利用建立的病原菌C.elegans模型，在C.elegans抵御病原菌的天然免疫信號(hào)通路方面取得了一系列的進(jìn)展， 發(fā)現(xiàn)C.elegans主要通過(guò)3條天然免疫信號(hào)通路抵御病原菌侵染，分別是絲裂原蛋白激酶(MAPK) 信號(hào)通路、DAF-2/DAF-16 信號(hào)通路和TGF-β信號(hào)通路 (圖1)。

圖1　C.elegans主要的三條天然免疫信號(hào)通路

2.1　絲裂原蛋白激酶信號(hào)通路

絲裂原蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路在動(dòng)物和植物中極其保守，也是線蟲中研究較深入的天然免疫信號(hào)通路。該通路包含三條不同激酶信號(hào)傳導(dǎo)方式，即細(xì)胞因子抑制的抗炎藥物結(jié)合蛋白激酶 (cytokine-suppressive anti-inflammatory drug-binding protein kinase)P38/MAPK、細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulation kinase)ERK/MAPK、氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase)C-JNK/MAPK。在研究PA的致病機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)P38/MAPK信號(hào)通路突變體更加容易導(dǎo)致線蟲致死，對(duì)PA表現(xiàn)為敏感。ERK/MAPK可以抵御革蘭陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)小棒狀桿菌、蘇云金芽胞桿菌等，C-JNK/MAPK對(duì)蘇云金芽胞桿菌中的Cry蛋白有防御作用[28]。

2.2　類胰島素受體/DAF-2/DAF-16信號(hào)通路

類胰島素受體(insulin-like)/DAF-2/DAF-16信號(hào)通路是在研究線蟲壽命中發(fā)現(xiàn)的，DAF-2的缺失突變體比正常的線蟲壽命更長(zhǎng)，Daf-2蛋白與胰島素受體相似，通過(guò)調(diào)節(jié)線蟲體內(nèi)FOXO家族轉(zhuǎn)錄因子DAF-16的細(xì)胞核定位參與線蟲的天然免疫、調(diào)節(jié)線蟲的壽命、應(yīng)激以及線蟲休眠狀態(tài)(Dauer)的啟動(dòng)等[29]；Daf-2蛋白受體活化后會(huì)使DAF-16保留在細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)有拮抗劑INS-1與Daf-2結(jié)合(或Daf-2功能缺失)等情況下，DAF-16不能被磷酸化就會(huì)進(jìn)入到細(xì)胞核中，并且激活一系列免疫、壽命相關(guān)基因的表達(dá)[29]。正向遺傳學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)Daf-2下游通過(guò)age-1/aap-1編碼的磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)激活絲氨酸/蘇氨酸激酶(例如PDK-1、SGK -1、AKT-1、AKT-2等)，使轉(zhuǎn)錄因子DAF-16磷酸化，阻止其從胞質(zhì)轉(zhuǎn)入核內(nèi)，抑制一系列基因的轉(zhuǎn)錄，其中在此通路上的任何缺失都會(huì)使轉(zhuǎn)錄因子DAF-16不能被磷酸化，使DAF-16從胞質(zhì)轉(zhuǎn)入核內(nèi)，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能[29]。Daf-2突變體對(duì)多種不同的病原菌均表現(xiàn)出抗性，研究發(fā)現(xiàn)DAF-16轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中后啟動(dòng)了多種抗菌基因的表達(dá)[30]。大多數(shù)p38/MAPK通路下游的病原菌誘導(dǎo)的免疫基因是由DAF-16/FOXO阻遏的[29]。另外，研究表明DAF-16的核定位調(diào)節(jié)參與多種反應(yīng)基因，因此DAF-2/DAF-16通路可能僅僅是一個(gè)應(yīng)激反應(yīng)的而不是一個(gè)特定的免疫應(yīng)答[30]。

2.3　轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路

該通路參與到線蟲的生長(zhǎng)發(fā)育，研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor-β，TGF-β)信號(hào)通路參與了線蟲抵御黏質(zhì)沙雷菌和銅綠假單胞菌的侵染[2]。TGF-β 受體具有蛋白絲氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域，TGF-β受體激活后可催化轉(zhuǎn)錄因子Smad發(fā)生絲氨酸磷酸化，磷酸化的Smad 子形成同源寡聚體或異源寡聚體后，進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄速度[2]。TGF-β通路調(diào)控多個(gè)免疫相關(guān)的基因：溶菌酶基因(如lys-1、lys-7、lys-8)、凝集素基因、神經(jīng)細(xì)胞分泌蛋白DBL-1基因(dbl-1)等，這些基因表達(dá)產(chǎn)物由腸上皮細(xì)胞分泌進(jìn)入腸腔發(fā)揮作用[2]。

2.4　其他防御反應(yīng)

除了以上的3個(gè)重要的天然免疫信號(hào)通路，還發(fā)現(xiàn)線蟲的損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)可以激活線蟲免疫反應(yīng)，DAMPs指宿主自身細(xì)胞被病原菌破壞從而釋放內(nèi)源性分子，即內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)，從而啟動(dòng)自身的免疫防御機(jī)制[30-31]。近幾年來(lái)發(fā)現(xiàn)的線蟲防御病原菌的DAMPs主要用細(xì)胞內(nèi)線粒體監(jiān)視通路(mitochondrial surveillance pathway)[31]、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白應(yīng)答(unfolded protein response，UPR)通路和自噬(autophagy)等[32]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)一些轉(zhuǎn)錄因子也參與線蟲防御病原菌的反應(yīng)，例如BAR1/βcatenin、EGL5 、bZIP轉(zhuǎn)錄因子zip2、FSHR1[33]等。

3　小結(jié)與展望

C.elegans具有個(gè)體小，生長(zhǎng)快，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，基因操作手段成熟，特別是具有海量的突變體庫(kù)，表型易觀察等特征，自從1999年開始以C.elegans為宿主模型來(lái)研究PA與宿主的相互作用以來(lái)，已經(jīng)在病原菌致病分子機(jī)制和宿主防御病原菌天然免疫方面取得了不錯(cuò)進(jìn)展。同時(shí)，這個(gè)領(lǐng)域的研究還處于剛剛起步階段，今后一段時(shí)期，C.elegans將在病原菌與宿主相互作用的眾多領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，例如，發(fā)現(xiàn)各種病原菌的毒素及毒力因子，尋找病原菌毒素受體，宿主防御病原菌的天然免疫信號(hào)通路及宿主識(shí)別病原菌機(jī)制等方面，這些相應(yīng)分子機(jī)制的揭示有助于更好的預(yù)防和治療病原菌引起的人畜傳染病。