?；勖簦觖慃?，張俊玉，呂　珊，尚江華，雷安民*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院/陜西省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，陜西楊凌 712100；2.農(nóng)業(yè)部(廣西)水牛遺傳繁育重點試驗室/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，廣西南寧 530001)

哺乳動物的原始生殖細(xì)胞出現(xiàn)于早期胚胎內(nèi)胚層，生殖嵴表面上皮細(xì)胞增殖形成初級性索，隨后有絲分裂且數(shù)目激增，初級性索退化，在性腺上皮形成次級性索。次級性索分離成多個獨立細(xì)胞團，稱之為原始卵泡[1]。當(dāng)生殖細(xì)胞不再分裂增殖且大量退化消失時，僅有一小部分卵原細(xì)胞生長并分化為初級卵母細(xì)胞，且全部進入第一次減數(shù)分裂，并停留在雙線期，稱為減數(shù)第一次分裂中期(metaphase Ⅰ，MⅠ)阻滯。MⅠ阻滯的卵母細(xì)胞被一層顆粒細(xì)胞包圍，隨著卵泡發(fā)育經(jīng)竇前卵泡形成生長卵泡，被卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)篩選出的優(yōu)勢卵泡在促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)峰來臨時，介導(dǎo)一系列分子使促成熟因子(maturation promoting factor，MPF)激活從而恢復(fù)減數(shù)分裂，形成成熟卵泡。隨后卵母細(xì)胞完成第一次減數(shù)分裂，于排卵前停留在第二次減數(shù)分裂中期，受精后完成第二次減數(shù)分裂[2]。在這整個過程中涉及到的多種生物學(xué)現(xiàn)象，例如分裂前期的物質(zhì)儲備以及隨后的檢查點停滯等，都為卵母細(xì)胞正常發(fā)育及成熟提供了必要條件。這些復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象受到雌性動物激素以及各種細(xì)胞因子及通路的精細(xì)調(diào)控，轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)通路是調(diào)控細(xì)胞生長的經(jīng)典通路，并被醫(yī)學(xué)界廣泛研究[3]。研究證明，TGF-β超家族的配體以及受體在多種動物卵泡中表達并存在受體表達特異性[4]。TGF-β超家族至少有35個成員，這些蛋白在身體里廣泛分布，作為細(xì)胞外配體參與出生前后的多種生理過程[5]。在多數(shù)細(xì)胞中，它可以下調(diào)轉(zhuǎn)錄激活因子c-myc的表達而抑制細(xì)胞的生長使其停滯在G1期[6]。此外，它也促進MMP1、CXCR4、Snail和Slug等基因的表達而增加細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵入能力。在卵母細(xì)胞發(fā)育中，TGF-β超家族參與卵母細(xì)胞發(fā)育的早期階段，調(diào)控激素受體、顆粒細(xì)胞擴散和卵母細(xì)胞成熟等相關(guān)基因的表達[7]。TGF-β通路包括配體、受體、細(xì)胞內(nèi)信號傳遞蛋白和轉(zhuǎn)錄因子。配體結(jié)合受體形成復(fù)合物，激活受體絲氨酸/蘇氨酸激酶，經(jīng)下游Smad因子傳遞相應(yīng)信號并由轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因的表達。其作用包括休眠原始卵泡的激活、顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞的增殖及凋亡、類固醇形成、促性腺激素受體表達、卵母細(xì)胞的成熟、排卵、黃體化和黃體形成等[8]。已有研究表明，TGF-β超家族成員可促進顆粒細(xì)胞擴散，進而阻斷顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間的通道連接，降低卵母細(xì)胞中的環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)含量，從而促進卵母細(xì)胞打破阻滯發(fā)育成熟。不僅如此，卵母細(xì)胞周圍的環(huán)境也直接或間接通過TGF-β通路調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，從而調(diào)控卵母細(xì)胞發(fā)育[9]。本文從TGF-β通路對卵母細(xì)胞的直接影響和間接影響方面就該通路在哺乳動物卵母細(xì)胞發(fā)育中的關(guān)鍵作用進行闡述。

1　TGF-β/Smad通路

TGF-β超家族作為一個龐大的蛋白因子庫，在多種細(xì)胞中含量可觀，在卵泡發(fā)育過程中起到相當(dāng)重要的作用。卵泡液中包含大量的TGF-β超家族配體成員，其受體也在卵泡多種細(xì)胞表面表達，接受內(nèi)分泌與旁分泌因子，傳遞信號以調(diào)節(jié)多種目的基因的表達。Smad 蛋白是TGF-β受體激酶的底物，直接接受膜受體信號，并傳遞至胞核中[10]。信號通路的下游是與目的基因表達相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控關(guān)鍵基因的表達從而發(fā)揮通路作用。

1.1　配體

TGF-β超家族因子有相似的序列和結(jié)構(gòu)特點，他們通過6個保守的半胱氨酸殘基發(fā)揮作用[11]，根據(jù)他們激活下游特異的Smad分子而將其分為2個亞家族TGF-β/Activin/Nodal和BMP/GDF/MIS。TGF-β/Activin/Nodal亞家族激活下游Smad2/3通路，作用于誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)合成，網(wǎng)織紅細(xì)胞分化，背部中胚層形成和促卵泡激素的釋放，以及抑制有絲分裂。BMP/GDF/MIS亞家族激活下游Smad1/5/8通路，可參與誘導(dǎo)腹側(cè)中胚層形成、軟骨和骨的形成以及細(xì)胞凋亡等作用。盡管TGF-β配體對細(xì)胞產(chǎn)生的作用不盡相同，但它們結(jié)構(gòu)特點相似，因此根據(jù)它們的生理作用將其劃分為TGF-βs(TGF-β1-5)、骨形成蛋白(BMPs,BMP2-16)、GDFs(GDF1-15)、激活素、抑制素。由于BMP1是一種金屬蛋白質(zhì)，將其歸為蝦紅素家族[12]。

1.2　受體

在受體絲氨酸/蘇氨酸家族包含12個成員，即7個Ⅰ型受體和5個Ⅱ型受體，它們在組成上都含有N端的細(xì)胞外配體結(jié)合位點，跨膜區(qū)和C端絲氨酸/蘇氨酸激酶位點。Ⅰ型受體包含典型的SGSGSG結(jié)構(gòu)，稱之為GS結(jié)構(gòu)域，Ⅱ型受體將Ⅰ型受體的GS結(jié)構(gòu)域磷酸化從而使其激活，因此，有活性的受體信號復(fù)合體包括配體和與之結(jié)合的兩種受體。一些受體的變體具有N末端或者C末端的延展，但是它們的具體功能還有待研究。而下游的直接受體R-Smads1、2、3、5和8是由它們的信號特異性來分組的[11]。Smads根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能被分為3種亞家族，其中5種受體激活型Smads(R-Smads)包括了Smad1、2、3、5和8，Smad6和7屬于抑制型Smads(I-Smads)，僅Smad4屬于通用Smad(So-Smads)。研究表明，Smad2和Smad3是卵巢發(fā)育和維持功能的重要因子[13]。

1.3　作用機制

TGF-β配體信號通過結(jié)合2種不同的絲氨酸-蘇氨酸激酶受體(即Ⅰ型受體與Ⅱ型受體)來發(fā)揮作用[12]。配體受體結(jié)合有兩種方式，例如骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)亞家族的一些成員先與Ⅰ型受體親和，而后配體-Ⅰ型受體復(fù)合物再與Ⅱ型受體親和；而與BMPs相比，TGF-βs 和激活素(Activin)則先與Ⅱ型受體結(jié)合，再與Ⅰ型受體合并形成一個大的配體受體復(fù)合物，包含1個配體二聚物和4個受體分子。隨后，形成細(xì)胞內(nèi)受體激酶結(jié)合位點，促進Ⅰ型受體磷酸化激活。不同的受體復(fù)合物激活不同的R-Smads，TGF-β亞家族主要激活Smad2和Smad3，BMP亞家族主要激活Smad1、5和8，而后再與Co-Smad即Smad4結(jié)合進入細(xì)胞核從而調(diào)控關(guān)鍵基因的表達。受體的激活受著嚴(yán)格的調(diào)控，例如，一些可溶性蛋白可阻止配體與受體的結(jié)合，起負(fù)調(diào)控作用。此外，關(guān)鍵調(diào)控基因BAMBI (BMP and activin receptor membrane bound inhibitor，BAMBI)由BMP操縱，其結(jié)構(gòu)與Ⅰ型受體極其相似，可以作為偽受體與Ⅰ型受體競爭配體，但不引起下游SMADs的磷酸化，從而對TGF-β通路起到負(fù)調(diào)控作用，使BMP保持合適的作用濃度[11]。因此，在卵泡中TGF-β信號通路中，內(nèi)部與外界環(huán)境調(diào)節(jié)受到各個環(huán)節(jié)的蛋白濃度影響，使其在卵母細(xì)胞成熟過程中發(fā)揮復(fù)雜而有序的作用。

2　TGF-β通路對卵母細(xì)胞發(fā)育的直接影響

卵泡作為卵母細(xì)胞生長發(fā)育的環(huán)境，為其提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)和生存條件，其中大部分因子來自于卵泡細(xì)胞的自分泌與旁分泌作用。究其成分發(fā)現(xiàn)卵泡液中一大類含量豐富作用廣泛的物質(zhì)來自于TGF-β超家族，如圖1所示，它們由卵母細(xì)胞以及卵泡顆粒細(xì)胞分泌，在卵泡及卵母細(xì)胞發(fā)育的不同時期調(diào)控其發(fā)育成熟[14]。已有研究表明，骨形成蛋白15(bone morphogenetic protein 15，BMP15)以及GDF9(growth and differentiation factor 9，GDF9)可促進卵丘顆粒細(xì)胞擴散以及卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂恢復(fù)，從而促進卵母細(xì)胞發(fā)育成熟[15]。

2.1　骨形成蛋白

哺乳動物卵巢組織中表達多種骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)，作為TGF-β超家族的主要成員之一，其在卵泡發(fā)育過程中起到關(guān)鍵作用。卵母細(xì)胞分泌的BMP-6、BMP-15和GDF-9，可以自分泌與旁分泌的形式發(fā)揮作用[16]，顆粒細(xì)胞分泌的BMP-2、BMP-5、BMP-6以及卵泡膜細(xì)胞分泌的BMP-2、BMP-4、BMP-7則通過旁分泌途徑調(diào)控卵母細(xì)胞發(fā)育[17]。研究表明，體外成熟培養(yǎng)豬卵母細(xì)胞時，BMP-15、GDF-9的表達量在生發(fā)泡破裂(germinal vesicle breakdown，GVBD)時期增加，在MⅠ期達到峰值，而在MⅡ期下降，期間還顯著增加卵母細(xì)胞成熟相關(guān)基因c-mos、Cyclin B1和cdc2以及顆粒細(xì)胞擴散相關(guān)基因Cas2、Ptgs2、Ptx3和Tnfaip6的表達，此外還增加了母源基因c-mos、Cyclin B1和cdc2的表達量，說明GDF-9和BMP-15參與豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)時期的顆粒細(xì)胞擴散,并刺激成熟相關(guān)因子和分裂蛋白激酶[18]。BMP-15和BMP-6具有調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的分裂增殖、卵丘擴展及卵泡膜細(xì)胞分化，抑制顆粒細(xì)胞凋亡等功能，對維持卵巢內(nèi)健康卵泡的發(fā)育有重要作用。GDF8是壁顆粒細(xì)胞生成的一種旁分泌因子，可以激活p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)通路,從而改變卵母細(xì)胞活性氧含量和成熟基因 Nrf2、Bcl-2以及顆粒細(xì)胞擴散相關(guān)基因PCNA、Nrf2、Has2、Ptx3和 TNFAIP6的表達，促進卵泡和卵母細(xì)胞的發(fā)育[19]。

圖中顯示了卵泡發(fā)育的不同時期所對應(yīng)的卵母細(xì)胞發(fā)育進程以及TGF-β超家族成員對其發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用

The figure shows the developmental stages of oocytes corresponding to different stages of follicular development and the regulatory role played by members of the TGF-β superfamily

圖1TGF-β超家族對卵泡及卵母細(xì)胞發(fā)育的直接影響

Fig.1Direct effect of TGF-β superfamily on follicular and oocyte development

2.2　激活素

激活素主要由顆粒細(xì)胞分泌，是類似于抑制素及卵泡抑素的一種非甾體類激素。其Ⅰ型受體與Ⅱ型受體分別在顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞及卵泡膜細(xì)胞上均有表達，激活素主要由顆粒細(xì)胞分泌，可以促進垂體合成并分泌FSH，增加顆粒細(xì)胞上FSH受體結(jié)合位點和芳香化酶活性的同時，促進雌激素E2的分泌。激活素以自分泌或旁分泌方式調(diào)控顆粒細(xì)胞增殖分化，促進卵母細(xì)胞成熟，提高卵泡發(fā)育能力，抑制卵泡閉鎖，而卵泡抑素能抑制其作用[20]。

2.3　抑制素

抑制素主要由顆粒細(xì)胞分泌，是一種異二聚體糖蛋白，其作用與激活素相反，可以抑制腦垂體分泌FSH，降低雌激素E2的分泌，在卵泡發(fā)育過程中起到負(fù)調(diào)控作用。抑制素和卵泡抑素協(xié)同抑制FSH的分泌，而激活素則中和其作用[20]。當(dāng)卵泡受到刺激時，抑制素B可通過對促性腺激素的應(yīng)答反映卵泡生長。有研究表明，促性腺激素刺激后抑制素B的預(yù)測值可能降低，它是臨床上超數(shù)排卵后的一個潛在生物標(biāo)志物，但不能指示懷孕[21]。因此，抑制素作為卵泡卵母細(xì)胞發(fā)育的負(fù)向調(diào)節(jié)蛋白，與激活素共同調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的精細(xì)發(fā)育。

2.4　TGF-βs

TGF-βs是一類調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育和分化的多功能多肽細(xì)胞因子，主要是在卵巢內(nèi)局部產(chǎn)生的，有5個亞型，哺乳動物只表達 TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，三者的生物學(xué)作用相似，可通過旁分泌、自分泌的形式發(fā)揮作用。已有研究表明，顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞均會分泌TGF-β1和TGF-β2[22]。其中TGFβ1是TGF-βs配體中最豐富的亞型，與卵泡發(fā)育、顆粒細(xì)胞的增殖、分化和排卵有關(guān)。TGF-β2位于卵泡膜細(xì)胞和黃體細(xì)胞中，它可以調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞中抑制素和活化素的產(chǎn)生[23]。在豬顆粒細(xì)胞中TGF-β2可以抑制FSH誘導(dǎo)的cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白的轉(zhuǎn)錄激活，從而調(diào)控卵母細(xì)胞的發(fā)育進程[24]。在TGF-βs的作用之下，卵泡細(xì)胞接受發(fā)育中信號得以正常增殖分化，卵母細(xì)胞減數(shù)分裂適時恢復(fù)。

2.5　抗苗勒管激素

抗苗勒管激素(AMH)是由顆粒細(xì)胞分泌，作為負(fù)調(diào)控因子以旁分泌與自分泌的形式作用于顆粒細(xì)胞，維持卵母細(xì)胞的MⅠ期阻滯，并抑制原始卵泡向生長卵泡發(fā)育。AMH可作為衡量雌性動物卵巢功能的指標(biāo)，其血清含量與卵泡質(zhì)量密切相關(guān)，可反映卵巢的儲備功能，因此，近幾年來AMH成為再生醫(yī)學(xué)研究的熱點。AMH在雌性動物性成熟后開始分泌，貫穿整個生育期，可以抑制卵泡的招募，隨著年齡的增長而分泌減少。試驗證明，血清中MHA含量與卵巢儲備量成正比[25]。在超數(shù)排卵試驗中AMH水平逐漸降低，此外，血清AMH水平與超數(shù)排卵后時間呈正相關(guān)，但與臨床妊娠無關(guān)[21]。 因此，AMH作為生育能力和卵巢發(fā)育狀況的指標(biāo)，為臨床醫(yī)學(xué)提供了很好的分子標(biāo)記。

3　TGF-β通路對卵母細(xì)胞的間接影響

除了直接作用于卵母細(xì)胞，TGF-β通路還可以通過顆粒細(xì)胞以及偶聯(lián)其他信號通路對卵母細(xì)胞發(fā)揮間接調(diào)節(jié)的作用(圖2)。體外成熟培養(yǎng)試驗表明，在卵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)和胚胎形成時期，多種蛋白的相互作用是關(guān)鍵[26]。因此，不同的蛋白途徑與TGF-β通路的作用相交織，使卵母細(xì)胞受到復(fù)雜而精確的調(diào)控。卵母細(xì)胞外的顆粒細(xì)胞保護卵母細(xì)胞不被損傷，其分泌的細(xì)胞因子通過卵泡或者縫隙連接與卵母細(xì)胞進行信息交流，激活下游的絲裂原激動蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和MPF等促進卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，與TGF-β超家族偶聯(lián)而促進卵母細(xì)胞成熟。但TGF-β通路與MAPK、MPF之間是如何建立的相互聯(lián)系還有待研究[18]。Smad2、AKT和MAPK P38的激活可能參與卵母細(xì)胞MⅠ中期向MⅡ中期轉(zhuǎn)化。Smad2、AKT和JNK1磷酸化與孕激素分泌呈正相關(guān)，與卵丘細(xì)胞凋亡呈負(fù)相關(guān)，這些參與者可以通過周圍的顆粒細(xì)胞來調(diào)節(jié)不同階段的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟[27]。

3.1　偶聯(lián)環(huán)腺苷酸途徑

cAMP在哺乳動物卵母細(xì)胞發(fā)育過程中控制著卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂恢復(fù)，而TGF-β超家族成員通過改變cAMP的產(chǎn)量而調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟。未成熟卵母細(xì)胞MⅠ期阻滯主要靠維持低活性MPF，細(xì)胞周期素依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)和細(xì)胞周期蛋白B1(Cyclin B1)分別為其催化亞單位和調(diào)節(jié)亞單位，然而CDK1滅活和細(xì)胞周期蛋白B1的恒定降解在MⅠ期阻滯時使MPF活性降低[28]。卵母細(xì)胞中高水平的cAMP是負(fù)責(zé)預(yù)防CDK1激活和維持卵母細(xì)胞MⅠ阻滯的關(guān)鍵[29]。當(dāng)LH峰到來之前，通道蛋白打開，顆粒細(xì)胞中的環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)進入卵母細(xì)胞中抑制cAMP磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)活性，使卵母細(xì)胞內(nèi)保持高濃度的cAMP。此外，cAMP依賴蛋白激酶(protein kinase A，PKA)與一些MPF調(diào)節(jié)組分(例如，合成細(xì)胞周期蛋白B或MEK / MAPK信號級聯(lián))的相互作用也有利于維持MⅠ期阻滯。而當(dāng)LH峰到來時，卵泡液中的LH 作用于顆粒細(xì)胞表面的LH受體，使通道蛋白關(guān)閉，cAMP很快被水解，CDK1被激活從而恢復(fù)卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂[30]。LH介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)致使大量分子激活CDK1，活性CDK1不僅在減數(shù)分裂恢復(fù)期間磷酸化不同的減數(shù)分裂磷酸蛋白，而且通過抑制CDK1拮抗蛋白磷酸酶(PPs)的活性來抑制其快速去磷酸化[31]，因此，MPF活性升高，減數(shù)分裂阻滯恢復(fù)。

3.2　偶聯(lián)激素途徑

哺乳動物的每個發(fā)情周期都有數(shù)個到數(shù)十個卵泡生長發(fā)育，而最終選擇個別優(yōu)勢卵泡成熟排卵。在卵泡液中，許多TGF-β超家族成員直接參與顆粒細(xì)胞增殖和類固醇調(diào)控，影響成熟促進因子(MPF)、細(xì)胞抑制因子(CSF)與其他信號的級聯(lián)，使卵母細(xì)胞周期受激素刺激調(diào)控。例如，生長分化因子9(GDF9)促進顆粒細(xì)胞擴散的同時也抑制孕酮生成[32]。雖然卵泡雌激素主要涉及維持前期阻滯，但成熟類固醇和膜孕激素受體參與卵母細(xì)胞中減數(shù)分裂G2～M1進程[31]。在卵泡募集過程中，對FSH反應(yīng)最強的被選為優(yōu)勢卵泡，此時顆粒細(xì)胞開始在FSH影響下表達LH受體，竇狀卵泡雌二醇(E2)產(chǎn)生增加，同時抑制垂體釋放FSH，因此FSH和LH協(xié)同支持卵泡發(fā)育。隨著優(yōu)勢卵泡發(fā)育，顆粒細(xì)胞逐漸擴散，期間需要促卵泡激素(FSH)和表皮生長因子(EGF)的活動以及卵母細(xì)胞分泌的卵丘擴張啟動因子(CEEF)，例如BMP15和GDF9[33]。很多試驗證明BMPs是黃素化的抑制劑，也是調(diào)節(jié)孕酮生成的關(guān)鍵因子，能提高顆粒細(xì)胞對FSH的反應(yīng)性，從而促進雌二醇產(chǎn)生的同時抑制黃體酮生成。雌激素可以促進卵泡發(fā)育及排卵，也誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞的增殖同時抑制其凋亡。此外，GDF9誘導(dǎo)透明質(zhì)酸合酶2(Has2)、環(huán)氧合酶2(COX2)、穿透素3(Ptx3)、前列腺素(Ptgs2)和卵丘細(xì)胞中g(shù)remlin(GREM1)基因的表達，促進顆粒細(xì)胞擴散。BMP15刺激細(xì)胞增殖，并調(diào)節(jié)類固醇激素的表達，在卵母細(xì)胞成熟后發(fā)生卵丘細(xì)胞擴張的時刻，BMP15表達有峰值。BMP15與GDF9相互作用，調(diào)整顆粒細(xì)胞擴散中基因的表達[34]。因此，TGF-β超家族因子不僅參與到卵母細(xì)胞的發(fā)育調(diào)節(jié)，還通過相關(guān)激素途徑影響了卵母細(xì)胞的生存環(huán)境以及關(guān)鍵的調(diào)節(jié)信號，共同促進卵泡及卵母細(xì)胞的成熟。然而TGF-β通路對激素更加精細(xì)的調(diào)控機理還有待進一步試驗研究。

3.3　偶聯(lián)EGF途徑

體外試驗表明，小鼠卵母細(xì)胞培養(yǎng)液中添加表皮生長因子(EGF)和TGF-β因子可以促進卵母細(xì)胞的成熟以及后期的胚胎發(fā)育[35]。在排卵前LH通過EGFR的信號傳導(dǎo)刺激卵泡中EGF家族中雙調(diào)蛋白，外調(diào)蛋白和β細(xì)胞素的產(chǎn)生，其引發(fā)的EGF樣因子足以誘導(dǎo)卵丘擴張以及卵母細(xì)胞成熟并促進排卵[15]。在卵泡的發(fā)育過程中，卵母細(xì)胞分泌的生長分化因子9(GDF9)激活下游Smad2/3，使FSH/EGF通過MAPK通路發(fā)揮作用。EGF 直接促進了GDF9作用的TGF-β通路，從而影響了顆粒細(xì)胞擴散基因的表達以及卵母細(xì)胞的成熟，該通路依靠EGF受體以及MAPK3/1的磷酸化，不受Alk4/5/7受體分支的影響而獨立發(fā)揮作用。EGF受體依賴的MAPK3/1磷酸化是顆粒和卵丘細(xì)胞中GDF9發(fā)揮功能所必需的。因此，除了其在排卵LH信號傳遞中的作用之外，EGF樣因子可以作為GDF9作用于顆粒細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[36]。進一步觀察結(jié)果表明，卵丘細(xì)胞中EGFR信號的激活與cAMP刺激的途徑一起觸發(fā)卵母細(xì)胞成熟和卵丘擴張。來自卵母細(xì)胞的EGF樣配體可以通過EGFR的激活磷酸化卵泡細(xì)胞中的MAPK，并關(guān)閉周圍顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞之間的縫隙連接通道，導(dǎo)致卵母細(xì)胞中cAMP水平的下降而誘發(fā)排卵。此外，EGF還能通過抑制顆粒細(xì)胞凋亡而促進卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量[37]。EGF對卵母細(xì)胞的調(diào)控復(fù)雜而有序，不同的通路之間各自獨立而又相互交織成網(wǎng)。大量的研究表明它們在卵母細(xì)胞及胚胎發(fā)育中起關(guān)鍵作用，但關(guān)于TGF-β通路與EGF在卵母細(xì)胞發(fā)育中的相互作用仍不清楚。

圖中顯示了TGF-β通路與EGF通路以及cAMP作用相偶聯(lián)的機制。箭頭表示對下游的促進作用，橫線表示對下游的抑制作用，虛線表示有待進一步實驗證明

The figure shows the mechanism by which the TGF-β pathway is coupled to the EGF pathway as well as the cAMP action.The arrow indicates the promotion effect to the downstream and the horizontal line indicates the inhibition to the downstream.Dotted line indicates the effect unknown

圖2TGF-β通路偶聯(lián)EGF途徑以及環(huán)腺苷酸途徑對卵母細(xì)胞成熟的影響

Fig.2Effect of TGF-β pathway coupled with EGF pathway and cyclic adenosine monophosphate pathway on oocyte maturation

4　小結(jié)與展望

TGF-β通路偶聯(lián)激素途徑調(diào)控FSH含量以及顆粒細(xì)胞對FSH的反應(yīng)，從而影響LH受體激增引起的EGFR通路和環(huán)核苷酸通路的激活，參與了哺乳動物的排卵前事件。BMPs通過促進顆粒細(xì)胞擴散以及卵母細(xì)胞成熟相關(guān)基因的表達促進成熟，但其抑制FSH誘導(dǎo)的類固醇激素生成。而激活素在誘導(dǎo)FSH生成方面與卵泡抑素和抑制素形成反向調(diào)控環(huán)節(jié)，共同維持FSH的適宜含量。AMH與MPF共同維持MⅠ阻滯，保證后續(xù)發(fā)育卵泡的質(zhì)量。當(dāng)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)，卵泡開始發(fā)育時，LH作為卵母細(xì)胞發(fā)育中的關(guān)鍵激素，感知FSH的變化而激活各個通路，精準(zhǔn)地調(diào)控卵泡發(fā)育過程中減數(shù)分裂的恢復(fù)，從而保證卵母細(xì)胞正常發(fā)育成熟。由于LH受體不表達于卵母細(xì)胞表面，因此由顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的LH引起縫隙連接蛋白開放，影響cAMP途徑從而啟動卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂恢復(fù)，促進其發(fā)育成熟(圖2)。

卵母細(xì)胞作為雌性生殖細(xì)胞直接影響動物的繁殖效率和質(zhì)量，因此，對其成熟的影響因素也將成為科學(xué)界關(guān)注的熱點。研究發(fā)現(xiàn)的外泌體作為特異性分泌的膜泡參與細(xì)胞間通訊，對卵母細(xì)胞成熟發(fā)揮舉足輕重的作用[38]?？傊徽撌锹涯讣?xì)胞內(nèi)在的還是外界的因素，它們組成一個共同的網(wǎng)絡(luò)有條不紊地調(diào)控著卵母細(xì)胞的發(fā)育。為了更加明確卵母細(xì)胞成熟過程中的調(diào)控機制，還需要對不同通路的不同因子進行更深入的研究，從而為臨床工作提供指導(dǎo)，而這項研究也會為人類精準(zhǔn)生殖醫(yī)學(xué)做出巨大貢獻。