楊康棟，李發(fā)炘，梁延昌，陳延鋒，林志豪，趙曉勤*

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510006；2.廣州體育學(xué)院，廣東廣州 510500)

骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是一種軟骨退行性病變和繼發(fā)骨質(zhì)增生為主要表現(xiàn)的慢性、進(jìn)展性、退行性關(guān)節(jié)病變，主要累及軟骨、滑膜、關(guān)節(jié)囊等結(jié)構(gòu)[1]，其中以膝骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率最高，占所有骨性關(guān)節(jié)炎的50%。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，我國(guó)骨性關(guān)節(jié)炎的患病率高達(dá)15%，60歲以上達(dá)50%[2-3]。目前膝骨性關(guān)節(jié)炎治療手段眾多，僅能減緩癥狀，未能從根本上改變膝骨性關(guān)節(jié)炎的病理生理進(jìn)程[4]，究其原因是膝骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制尚不明確[5]。有研究指出，前列腺素(prostaglandin，PG)E2、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、基質(zhì)金屬蛋白酶3(matrix metallo proteinase 3,MMP-3)等活性因子在膝骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要的作用[6-7]。中醫(yī)藥治療膝骨性關(guān)節(jié)炎具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可以改善癥狀，提高生活質(zhì)量，減緩病程[8-9]。但是其作用機(jī)制尚不明確。因此，本試驗(yàn)建立了膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，用雙合湯進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍、關(guān)節(jié)滑膜厚度和關(guān)節(jié)液中PGE2、MDA、SOD、MMP-3表達(dá)的影響，探討其防治膝骨性關(guān)節(jié)炎的可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼料SD健康雄性大鼠80只，SPF級(jí)，9周齡，體重190 g±10 g,基礎(chǔ)飼料,均由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(粵)2013—0002。

1.1.2藥品雙合湯(當(dāng)歸15 g，川芎15 g，白芍20 g，生地黃15 g，陳皮6 g，法半夏15 g，茯苓15 g，桃仁15 g，紅花10 g，白芥子10 g，甘草6 g，桑寄生15 g，杜仲15 g)，由廣東康美藥業(yè)股份有限公司提供，每味中藥單獨(dú)包裝，經(jīng)營(yíng)許可證號(hào)為粵AA2001217。將上述中藥飲片加8倍量的水浸泡30 min后，煎煮40 min，取藥液過(guò)濾另存，再加6倍量的水煎煮40 min后取液過(guò)濾，將2次藥液混合，置于100℃環(huán)境濃縮至1 mL，相當(dāng)于原藥6 g，置于冰箱保存；鹽酸氨基葡萄糖片，四川綠葉制藥股份有限公司產(chǎn)品，規(guī)格：240 mg/片，42片/盒，國(guó)藥準(zhǔn)字H20060802，批號(hào)2016090。

1.1.3試劑和儀器大鼠關(guān)節(jié)液PGE2、MDA、SOD、MMP-3酶聯(lián)免疫試劑盒，美國(guó)R&D Systems公司產(chǎn)品，購(gòu)自上海通蔚實(shí)業(yè)有限公司；上海恒平AE523C電子分析天平，購(gòu)自上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；TGL16D冷凍離心機(jī)，購(gòu)自湖南邁達(dá)儀器有限公司；日立熒光分光光度計(jì)F-2700，購(gòu)自廣州市儀德科學(xué)儀器有限公司；水合氯醛，揚(yáng)州市奧鑫助劑廠產(chǎn)品；902-ULTS超低溫冰箱，美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品。

1.2　方法

1.2.1造模方法和分組所有大鼠在造模前置于室溫(24℃±2℃)、濕度(50%±5%)條件下給予基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，待其代謝狀態(tài)穩(wěn)定后隨機(jī)分為假手術(shù)組(20只)、模型組(60只)，每6只分籠喂養(yǎng)。參照Panicker S等[10]制備大鼠膝骨性關(guān)節(jié)炎模型：腹腔水合氯醛麻醉下于雙膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射濃度為40 mg/mL的木瓜蛋白酶溶液0.2 mL，每2天1次，共注射2周。假手術(shù)組雙膝關(guān)節(jié)腔注射等量的生理鹽水。造模期間所有大鼠均自由進(jìn)食基礎(chǔ)飼料和蒸餾水。2周后若大鼠膝關(guān)節(jié)評(píng)分大于4分為建模成功[11]。2周后，假手術(shù)組20只全部存活，模型組死亡1只，2只未達(dá)KOA模型的標(biāo)準(zhǔn)，予以剔除，剩下57只隨機(jī)分為模型組(n=19)、氨基葡萄糖組(n=19)和雙合湯組(n=19)。

1.2.2給藥方法參照人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值表，氨基葡萄糖組給予鹽酸氨基葡萄糖劑量為每日86.4 mg/kg，加生理鹽水配成22 mg/mL的濃度灌胃；雙合湯組給予每日12 g/kg雙合湯灌胃，每天灌胃1次；假手術(shù)組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，給藥周期為4周。

1.2.3指標(biāo)檢測(cè)分別在2周和6周各取一半的大鼠進(jìn)行檢測(cè)。100 mg/mL水合氯醛溶液(3 mL/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉，于外膝眼處向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入0.5 mL生理鹽水后，反復(fù)活動(dòng)關(guān)節(jié)后抽取關(guān)節(jié)液，3 000 r/min離心20 min后取上清液，置-70℃保存。ELISA法測(cè)定關(guān)節(jié)液PGE2、MDA、SOD、MMP-3的水平。

1.2.4大鼠關(guān)節(jié)后動(dòng)度麻醉狀態(tài)下，用相等的力伸展后回縮大鼠膝關(guān)節(jié)，用量角器測(cè)量其伸展至回縮的角度[12]。

1.2.5關(guān)節(jié)滑膜厚度處死大鼠，打開(kāi)關(guān)節(jié)腔后刮取關(guān)節(jié)面上的滑膜組織，用螺旋測(cè)微器測(cè)定關(guān)節(jié)滑膜厚[12]。

2　結(jié)果

2.1　各組大鼠關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍、關(guān)節(jié)滑膜厚度檢測(cè)結(jié)果

造模2周后，模型組、氨基葡萄糖組和雙合湯組大鼠的關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍低于假手術(shù)組，關(guān)節(jié)滑膜厚度明顯高于假手術(shù)組，差異顯著(P<0.05)；藥物干預(yù)4周后，跟假手術(shù)組相比，模型組關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍繼續(xù)降低，關(guān)節(jié)滑膜厚度繼續(xù)增加，差異顯著(P<0.05)；與模型組比較，雙合湯組大鼠關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍明顯升高，關(guān)節(jié)滑膜厚度明顯降低，差異顯著(P<0.05)(表1)。

2.2　各組大鼠關(guān)節(jié)液MDA、SOD的檢測(cè)結(jié)果

造模2周后，模型組、氨基葡萄糖組和雙合湯組大鼠的關(guān)節(jié)液各組大鼠關(guān)節(jié)液MDA水平明顯高于假手術(shù)組，SOD水平明顯降低，差異顯著(P<0.05)；藥物干預(yù)4周后，與對(duì)照組相比，模型組大鼠關(guān)節(jié)液MDA水平繼續(xù)增加，SOD水平繼續(xù)下降，差異顯著(P<0.05)；與模型組比較，雙合湯組大鼠關(guān)節(jié)液MDA水平明顯降低，SOD水平明顯升高，差異顯著(P<0.05)(表2)。

2.3　各組大鼠關(guān)節(jié)液PGE2、MMP-3的檢測(cè)結(jié)果

造模2周后，模型組、氨基葡萄糖組和雙合湯組大鼠的關(guān)節(jié)液PGE2、MMP-3水平明顯高于假手術(shù)組，差異顯著(P<0.05)；藥物干預(yù)4周后，與對(duì)照組相比，模型組大鼠關(guān)節(jié)液PGE2、MMP-3水平繼續(xù)增加，差異顯著(P<0.05)；跟模型組比較，雙合湯組大鼠關(guān)節(jié)液PGE2、MMP-3水平明顯降低，差異顯著(P<0.05)(表3)。

表1　各組大鼠關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍和關(guān)節(jié)滑膜厚度的檢測(cè)結(jié)果

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，ΔP<0.05。

Note：Compared with the control group，*P<0.05；Compared with the model group，ΔP<0.05.

表2　各組大鼠關(guān)節(jié)液MDA和SOD的檢測(cè)結(jié)果

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，ΔP<0.05。

Note：Compared with the control group，*P<0.05；Compared with the model group，ΔP<0.05.

3　討論

膝骨性關(guān)節(jié)炎是骨科常見(jiàn)病和多發(fā)病之一，臨床主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)僵硬、活動(dòng)受限等。隨著老齡化進(jìn)程的加速，膝骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率和患病率呈現(xiàn)明顯上升的趨勢(shì)。目前臨床上治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的手段較多，但是因?yàn)椴荒軠p緩膝骨性關(guān)節(jié)炎的病理生理學(xué)進(jìn)程，因而臨床效果受到一定的限制。中醫(yī)藥治療本病可以改善膝關(guān)節(jié)功能，提高生活質(zhì)量，應(yīng)用越來(lái)越廣泛，但是關(guān)于其作用機(jī)制尚不明確。

表3　各組大鼠關(guān)節(jié)液PGE2和MMP-3的檢測(cè)結(jié)果

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，ΔP<0.05。

Note：Compared with the control group，*P<0.05；Compared with the model group，ΔP<0.05.

大量研究表明，包括氧自由基、金屬基質(zhì)蛋白酶、前列腺素E2等多種活性因子在膝骨性關(guān)節(jié)病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到非常重要的作用，各種活性因子間的綜合作用誘導(dǎo)膝骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展。氧自由基參與膝骨性關(guān)節(jié)炎的病理進(jìn)程，氧自由基可以抑制軟骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)軟骨細(xì)胞死亡，抑制基質(zhì)蛋白多糖和膠原的形成，降低自由基的含量，從而促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨破壞[13]。而MDA是氧自由基的代表物質(zhì)，MDA可以反應(yīng)機(jī)體氧自由基的水平。SOD為氧自由基清除劑，可以防止氧自由基對(duì)軟骨細(xì)胞和細(xì)胞基質(zhì)的破壞，保護(hù)細(xì)胞，防止膝骨性關(guān)節(jié)炎的進(jìn)程，當(dāng)關(guān)節(jié)炎較為劇烈，SOD大量消耗。MDA和SOD可以反應(yīng)膝骨性關(guān)節(jié)炎的病情和療效。PGE2是一種炎癥介質(zhì)，可以導(dǎo)致軟骨吸收障礙，抑制蛋白多糖形成，影響骨代謝，從而介導(dǎo)骨性關(guān)節(jié)炎[14-15]。同時(shí)PGE2還可以促進(jìn)IL-1對(duì)軟骨的降解。MMP-3由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，可以促進(jìn)細(xì)胞基質(zhì)、細(xì)胞外基底膜和軟骨膠原的降解，是骨性關(guān)節(jié)炎的重要標(biāo)志物[16]。

關(guān)于膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠模型建立的方法主要有切斷膝關(guān)節(jié)炎前交叉韌帶、木瓜蛋白酶注射法、卵巢切除法等。由于關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶法具有復(fù)制成功率高、穩(wěn)定可靠等優(yōu)勢(shì)，是目前實(shí)驗(yàn)研究中最常見(jiàn)的模型建立方法。本試驗(yàn)采用關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶法建立膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，結(jié)果提示，造模2周后模型組大鼠關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍明顯減少，關(guān)節(jié)滑膜厚度明顯增加，關(guān)節(jié)液PGE2、MDA、MMP-3水平明顯增加，SOD水平明顯降低，提示膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠模型復(fù)制成功。表明本試驗(yàn)中采用關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶法建立膝骨性關(guān)節(jié)炎的大鼠模型是切實(shí)可行的，模型的成功建立為后續(xù)干預(yù)提供了基礎(chǔ)。

膝骨性關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)學(xué)“痹病”范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病為本虛標(biāo)實(shí)之病，本虛為肝腎虧虛，標(biāo)實(shí)為風(fēng)寒濕、血瘀痹阻筋絡(luò)，肝腎虧虛貫穿疾病的始終，風(fēng)寒濕、血瘀是重要的病理產(chǎn)物，也是重要的中心環(huán)節(jié)。雙合湯養(yǎng)血活血，健脾化痰。方中當(dāng)歸活血養(yǎng)血，川芎、桃仁、紅花活血化瘀，桑寄生、杜仲補(bǔ)腎壯腰強(qiáng)骨，生地、白芍養(yǎng)陰生津，陳皮、法半夏、白芥子燥濕化痰，茯苓、甘草健脾化濕。諸藥合用，共奏養(yǎng)血活血，健脾化痰之功效。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，造模成功后膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠給予藥物灌胃4周后，雙合湯組大鼠關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍增加，關(guān)節(jié)滑膜厚度降低，關(guān)節(jié)液中PGE2、MDA、MMP-3水平明顯降低，SOD水平明顯升高。表明雙合湯可以降低膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)液PGE2、MDA、MMP-3的水平，升高SOD水平，改善膝關(guān)節(jié)功能，發(fā)揮治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的作用。

綜上所述，雙合湯治療膝骨性關(guān)節(jié)炎是有效的，可以改善膝關(guān)節(jié)功能，可能與其抑制關(guān)節(jié)液中PGE2、MDA、MMP-3的表達(dá)和促進(jìn)SOD的表達(dá)有關(guān)。