李燭南，盧怡竹，王振國，劉志杰，殷　宏，，曾巧英

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅蘭州 730070;2.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室，甘肅蘭州 730046；3.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇揚州 225009)

無漿體(Anaplasma)屬于立克次體目、無漿體科、無漿體屬，是一類蜱傳播的專性細胞內(nèi)寄生菌，主要寄生于牛羊等反芻動物的血細胞中，其引起的疾病被稱為無漿體病。主要的無漿體病原包括邊緣無漿體(Anaplasmamarginale)、綿羊無漿體(A.ovis)、中央無漿體(A.centrale)、牛無漿體(A.bovis)、嗜吞噬細胞無漿體(A.phagocytophilum)和扁平無漿體(A.platys)[1-2]。嗜吞噬細胞無漿體是一種人畜共患病病原體。該病原呈全球范圍分布，主要通過硬蜱屬的蜱傳播，感染包括人在內(nèi)的大部分哺乳動物，是一類重要的動物源性人獸共患蜱傳病。2006年安徽蕪湖暴發(fā)的人群體性不明原因發(fā)熱的疫情，繼發(fā)感染病人均為接觸嗜吞噬細胞無漿體感染的原發(fā)病人血液或體液引起。最終這次疫情被確診為人粒細胞無漿體病(Human granulocytic anaplasmosis,HGA)，該病也被衛(wèi)生部定為我國新發(fā)傳染病[3]。

新疆是全國五大牧區(qū)之一，同時也是硬蜱種類較多的省份之一，馬屬動物養(yǎng)殖業(yè)是新疆畜牧業(yè)發(fā)展的重要產(chǎn)業(yè)。昭蘇縣位于伊犁河上游特克斯河流域，是伊犁馬等馬種的重要牧養(yǎng)區(qū)。畜牧業(yè)生產(chǎn)方式使牧民和家畜有密切接觸的機會,特別是蜱蟲孳生季節(jié),散養(yǎng)家畜體表寄生大量硬蜱,加大了蜱傳人獸共患病傳播給人群的風險。為了調(diào)查新疆昭蘇地區(qū)的馬是否存在嗜吞噬細胞無漿體感染情況，我們對當?shù)伛R匹進行了血清學及病原分子生物學調(diào)查分析。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1樣品2012年在新疆省昭蘇縣對100匹馬進行了血液樣品采集。每匹馬分別采集2份樣品，1份用于DNA提取，另1份用于血清制備。

1.1.2主要試劑Focus Technilogies HGA IFA IgG Test Kit，美國VMRD公司產(chǎn)品；QIAamp DNA Mini Kit，德國QIAGENQ公司產(chǎn)品；pGEM-T easy Vector，美國Promega公司產(chǎn)品；Gel Extraction Kit，美國Omega Bio-Tek公司產(chǎn)品；JM-109感受態(tài)細胞、RNase-free water、EXTaqDNA聚合酶，DNA Marker DL 2 000，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.2　方法

1.2.1樣本基因組DNA提取按照DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN,Hilden,Germany)操作說明，將采集保存在EDTA-K2中的血液樣品吸取300 μL，加入900 μL紅細胞裂解液，室溫放置15 min后，13 000 r/min離心30 s,棄掉上清液保留沉淀。在沉淀中加300 μL白細胞裂解液，渦旋10 s。再加入100 μL蛋白沉淀試劑，渦旋20 s后，13 000 r/min離心1 min。將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入300 μL的異丙醇顛倒至出現(xiàn)白色絮狀物，13 000 r/min離心1 min。棄掉上清液，沉淀中加入300 μL 700 mL/L乙醇，顛倒至沉淀懸浮，13 000 r/min離心1 min。倒去乙醇，靜置曬干后加入DNA水合溶劑，封裝置-20℃保存。

1.2.2間接熒光免疫(IFA)檢測采用間接熒光免疫法(IFA)，檢測馬血清中IgG抗體。操作按照試劑盒說明書進行，首先將專用載玻片從冰箱中取出，為避免表面有冷凝水，可待玻片至室溫后再打開包裝。標準陰性、陽性對照樣品用PBS按照1∶32稀釋后，每孔加25 μL，并設(shè)復孔。待測樣品用PBS按照1∶64稀釋后，每孔加入25 μL，37℃孵育30 min。接著，1×PBS溶液洗滌3次，在純水中輕輕漂洗后取出晾干。每孔加入25 μL酶標試劑，37℃孵育30 min后重復上述洗滌操作。每孔加入少許緩沖甘油，蓋上蓋玻片后置于100×熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。在熒光顯微鏡下，100倍放大后觀察，出現(xiàn)3個以上與陽性對照類似形狀的熒光點時，判定為為陽性。

1.2.3PCR擴增將間接熒光免疫法(IFA)檢測到的陽性樣品相對應的基因組樣品用來進行PCR擴增。PCR均在25 μL反應體系中進行，嗜吞噬細胞無漿體16S rRNA基因擴增的引物序列見(表1)。第一輪采用EC9/EC12A[3]，擴增條件為：94℃ 4 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min。第二輪采用SSAP2f/SSAP2r[3]，擴增條件為：94℃ 4 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR反應體系：25 μL反應體系中含2.5 μL 10×PCR緩沖液，2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，上、下游引物各0.5 μL(20 pmol/μL), 0.125 μL ExTaqDNA聚合酶(5 U/μL)，2 μL DNA樣品，17.375 μL RNase-free water。

表1　PCR引物序列

1.2.4核酸序列測定及系統(tǒng)進化分析用Gel Extraction Kit (OMEGA)試劑盒將PCR產(chǎn)物進行回收，將回收后的PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T easy載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至JM-109感受態(tài)細胞中。每份陽性樣品至少挑取3個陽性克隆，并將得到的陽性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司進行測序。將測序得到的序列在GenBank中進行BLAST檢索比對分析，下載相似度高的序列，并使用MEGA 6.0軟件進行多重序列比對(ClustalW法)，選用Neighbor-Joining (NJ)，Bootstrap分析重復數(shù)為1 000參數(shù)，繪制嗜吞噬細胞無漿體系統(tǒng)發(fā)生樹。

2　結(jié)果

2.1　嗜吞噬細胞無漿體IgG檢測結(jié)果

將調(diào)查地區(qū)采集的100份馬血清樣品進行間接熒光免疫(IFA)檢測，嚴格按照說明書以如下的標準進行評判(圖1)。檢測時，采用了將樣品用PBS溶液稀釋64倍后鏡檢的方法，顯微鏡下觀察到3個以上特異綠色熒光點即判定為陽性，共檢測到了8份IgG抗體陽性樣品，陽性率為8.0%(8/100)。

2.2　PCR檢測結(jié)果

將上述嗜吞噬細胞無漿體IgG檢測結(jié)果為陽性的相對應基因組樣品,進行16S rRNA基因的擴增，將擴增產(chǎn)物進行克隆后測序，共有6份陽性樣品測序成功，確證了嗜吞噬細胞無漿體感染。

2.3　核酸序列比較

將6份所得的嗜吞噬細胞無漿體16S rRNA基因序列進行比對，有2種基因型ZS23(MF992253)和ZS40(MG002405)，ZS23(MF992253)相比ZS40(MG002405)存在4個堿基的突變與1個堿基的缺失，其序列相似性為99.4%。將這2條基因序列分別與GenBank中相應的序列進行相似性分析。ZS23 (MF992253)的基因序列與中國山羊檢出序列(JN558816)和土耳其牛檢出序列(KP745629)相似性為98.6%。ZS40(MG002405)的基因序列與美國加利福尼亞馬檢出序列(AF172166)相似性為98%，與中國牛檢出序列(KJ782388)相似性為99%。分析結(jié)果進一步說明伊犁昭蘇縣的馬存在嗜吞噬細胞無漿體感染，且存在的2種基因型均已在我國和周邊國家報道。

A.陽性對照；B.陰性對照；C.樣品(30號)；D.樣品(17號)

A.Positive control;B.Negative control;C.Sample(№30);D.Sample(№17)

圖1嗜吞噬細胞無漿體間接熒光免疫檢測

Fig.1Indirect immunoinfluscent assay for detection ofA.phagocytophilum

2.4　系統(tǒng)進化分析

系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示，來自馬血液樣品中的嗜吞噬細胞無漿體16S rRNA基因序列均分布在同一分支上。它們與來自國內(nèi)羊中的基因型(KR002113)、日本的梅花鹿中的基因型(LC060987)均處于同一分支；而與來自美國的馬中的基因型(AF172165)和來自日本硬蜱中的基因型(AY909615)不在同一分支(圖2)。

圖2　利用16S rRNA基因序列繪制的系統(tǒng)進化樹

3　討論

昭蘇縣位于伊犁河上游特克斯河流域，植被茂密的北疆地區(qū)，是自然疫源性疫病的流行地區(qū)。歷史上該地區(qū)在病原學上證實為蜱傳斑點熱自然疫源地[4-5]。本次調(diào)查證實了當?shù)伛R場馬匹血清中嗜吞噬細胞無漿體陽性率為8.0%，低于北美地區(qū)馬場[6]。無漿體初次感染動物之后，感染的動物終生帶菌，形成持續(xù)感染。有研究表明，持續(xù)感染過程中，病原會由于基因突變等原因產(chǎn)生抗原變異，逃避免疫清除[7]。由于持續(xù)感染，受感染宿主動物會持續(xù)產(chǎn)生抗無漿體感染抗體，這一特征有利于利用血清學方法檢測無漿體的感染情況。本研究中，檢測到了8份血清學陽性樣品，但僅從其中6份陽性樣品相對應的DNA樣品中檢測擴增到了16S rRNA基因序列，這有可能是由于一些受感染動物的染菌率低，導致制備的樣品中菌體DNA含量過少而沒能通過PCR檢測到所致。然而，本研究所獲得的6份陽性樣品及其序列，充分證明了新疆昭蘇地區(qū)的馬存在嗜吞噬細胞無漿體的感染情況。該病原為人獸共患病病原，因此，當?shù)鼐邆溆墒韧淌杉毎麩o漿體感染而引起公共衛(wèi)生問題的風險。

本研究中，對PCR檢出并測序成功的16S rRNA序列做了比對與同源性分析，結(jié)果顯示，該地區(qū)嗜吞噬細胞無漿體16S rRNA存在2種基因型，ZS23和ZS40，ZS40相比ZS23存在4個堿基的突變與1個堿基的缺失，其序列相似性為99.4%。同源比較分析顯示，ZS23變異株的基因序列分別于與中國的山羊和土耳其牛[8]中檢出序列高度同源(98.6%)。而ZS40變異株的基因序列與美國加利福尼亞馬[9]和國內(nèi)的牛中發(fā)現(xiàn)的病原序列同源。昭蘇地區(qū)發(fā)現(xiàn)的嗜吞噬細胞無漿體與國內(nèi)外其他宿主動物攜帶的嗜吞噬細胞無漿體較為相似，這一結(jié)果為該地區(qū)的嗜吞噬細胞無漿體的診斷防治提供了一定的依據(jù)。

嗜吞噬細胞無漿體在我國分布相當廣泛，患病及攜帶病原宿主多樣，目前在國內(nèi)多個省份已有報道，臨床表現(xiàn)復雜多樣，是一種嚴重危害人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展的媒介傳染病。我國于2006年在安徽省發(fā)現(xiàn)首例人粒細胞無漿體病病例，截止目前在我國甘肅、青海、吉林、湖南、山西、北京、貴州、河南、山東、云南福建、新疆云南等省份通過血清學調(diào)查發(fā)現(xiàn)均有嗜吞噬細胞無漿體感染人的情況[10-17]。嗜吞噬細胞無漿體主要在宿主動物和蜱之間循環(huán)，傳染源即儲存宿主。宿主種類繁多，國內(nèi)現(xiàn)已報道有多種家畜可作為本病的宿主，包括馬、牛、羊等家畜[18-20]，以及鳥、鼠等野生動物[21-22]體內(nèi)均有感染或攜帶的情況。蜱蟲叮咬是嗜吞噬細胞無漿體主要的傳播方式。在我國，全溝硬蜱是該病原主要的傳播媒介，已從內(nèi)蒙古、新疆、黑龍江和吉林的全溝硬蜱中檢測到嗜吞噬細胞無漿體的16S rRNA序列[23]。因此，對嗜吞噬細胞無漿體儲存宿主和傳播媒介的控制將有助于防控該病在我國的流行。